[發明專利]東佛里生奶綿羊冷凍精液制備方法

在審

• 申請號: 202210750285.5
• 申請日: 2022-06-29
• 公開（公告）號: CN114903032A
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 張磊;宋宇軒;姜璐遙;劉曉瑞;衛夢瑤;崔久增;李丹妮
• 申請（專利權）人: 西北農林科技大學
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 東莞市卓易專利代理事務所(普通合伙) 44777
• 代理人: 陳桂香

1.一種東佛里生奶綿羊冷凍精液制備方法，其特征在于，它包括以下步驟：

(1)精液冷凍稀釋液的配制：

將葡萄糖3.1g，乳糖4.6g，檸檬酸鈉1.5g，加85mL超純水溶解，調節pH至7，用0.22μm濾器過濾；加入青霉素、鏈霉素各5萬單位和15mL卵黃，得到Ⅰ液，放至38℃水浴鍋中保存備用；

取配制好的Ⅰ液，加入6％甘油，調節pH至7后得到Ⅱ液，4℃保存備用。

(2)精液檢查

①外觀評定

1)射精量：采精后用移液器移至有刻度的無菌離心管中觀察；

2)色澤：東佛里生奶綿羊的正常精液呈乳白色或乳黃色；

3)云霧運動：用肉眼觀察新采集的東佛里生奶綿羊公羊精液，可以看到由精子活動所引起的翻騰滾動似云霧狀；精子密度越大，活力越強，其云霧狀越明顯，

②活力檢測

用移液器從1)的離心管中取適量精液滴在載玻片上，壓片后至于顯微鏡下鏡檢，活率≥80％即可進行冷凍；

(3)精液稀釋

①Ⅰ液稀釋：取Ⅰ液按照1：1的比例分步稀釋至精子終濃度計算所需體積的一半，每次添加后輕輕搖勻，用18層紗布包裹放至4℃中平衡1.5-2h；

②Ⅱ液稀釋：在4℃環境中按照1：1緩慢加入Ⅱ液，搖勻后放入4℃中繼續平衡1.5-2h；

(4)封裝和冷凍保存

精液搖勻，按每支250μL，500萬精子裝管，裝好后擺放至冷凍搓板上，然后放入程序冷凍儀中，按照5℃～-10℃內-5℃/min，-10℃～-100℃內-40℃/min，-100℃～-140℃

內-20℃/min的降溫程序進行冷凍，最后將凍精投入液氮中保存。