[發明專利]一種PRM檢測促黃體生成素的試劑盒及檢測方法和應用

在審

• 申請號: 202210745947.X
• 申請日: 2022-06-28
• 公開（公告）號: CN115097041A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 王翔宇;儲明星;狄冉;賀小云
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 張夢澤

本發明屬于定量分析檢測技術領域，具體涉及一種PRM檢測促黃體生成素的試劑盒及檢測方法和應用；所述試劑盒包括以下組分：促黃體生成素的重同位素標記肽段、質譜檢測用試劑和納升級高效液相色譜檢測用試劑。本發明通過促黃體生成素的重同位素標記肽段對促黃體生成素進行絕對定量分析，以幫助綿羊發情階段的判定，具有方便快捷，高選擇性，高特異性及準確度高的優點，蛋白檢測可達pg/mg水平。同時，本發明的試劑盒還能避免放射性免疫分析試劑的使用。

技術領域

本發明屬于定量分析檢測技術領域，具體涉及一種PRM檢測促黃體生成素的試劑盒及檢測方法和應用。

背景技術

促黃體生成素(Luteotropic hormone，LH)是由腺垂體細胞分泌的一種糖蛋白類促性腺激素，可促進膽固醇在性腺細胞內轉化為性激素。在綿羊排卵前會產生LH高峰，在LH峰后6～12h排卵。越靠近排卵時間完成配種就可以提高妊娠效果。因而實時定量檢測綿羊的LH含量，能夠實時監控綿羊排卵時間，進而確定最佳配種時期。

目前檢測LH的方法主要有放射免疫分析法和酶聯免疫分析法，其中放射免疫分析法有污染，分析試劑有效期短，操作繁瑣；而酶聯免疫分析法采用化學發光和熒光體系靈敏度低，測值不夠準確，檢測范圍窄，保質期短。并且，放射免疫分析法和酶聯免疫分析法都需要制備綿羊的單克隆抗體，綿羊的單克隆抗體制備難度較大不易獲得，限制了LH檢測的推廣和應用。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種PRM檢測促黃體生成素的試劑盒及檢測方法，本發明的方法擺脫了綿羊的單克隆抗體的限制，并且具有高靈敏度、高特異性的優點。

本發明提供了一種PRM檢測促黃體生成素的試劑盒，包括以下組分：促黃體生成素的重同位素標記肽段、質譜檢測用試劑和納升級高效液相色譜檢測用試劑。

優選的，所述促黃體生成素的重同位素標記肽段包括重同位素標記的第一多肽和第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

優選的，所述重同位素標記位于肽段序列C-最末端的氨基酸上。

優選的，所述促黃體生成素的重同位素標記肽段的肽段序列C-最末端的氨基酸上的C12和N14分別用C13和N15替代。

優選的，每條所述促黃體生成素的重同位素標記肽段的濃度為200～1000fmol/ml。

優選的，還包括色譜分析柱；所述色譜分析柱包括柱管、填料和槍頭；所述填料填充于柱管內；所述槍頭套在柱管的一端；所述的柱管長度為245～255mm、外徑為355～365μm、內徑為70～80μm；所述的填料包括C18反相填料；所述C18反向相填料的粒徑為1.5～2.5μm。

本發明提供了一種基于上述方案所述的試劑盒的PRM檢測促黃體生成素的方法，包括以下步驟：

1)對待測溶液進行酶解，得到含促黃體生成素的肽段，作為目標肽段；將所述目標肽段和促黃體生成素的重同位素標記肽段混合，得到混合肽段；

2)對所述混合肽段進行納升級高效液相色譜分離，得到高效液相色譜分離后的肽段；

3)對所述高效液相色譜分離后的肽段進行PRM檢測，得到質譜數據；

4)對所述質譜數據進行定量分析，得到促黃體生成素的定量結果。

優選的，步驟2)中所述納升級高效液相色譜分離的條件包括：

進樣量：2μL；

流動相：流動相A和流動相B；所述流動相A為體積濃度為0.1％的甲酸水溶液；所述流動相B為甲酸-乙腈水溶液，所述甲酸-乙腈水溶液中甲酸的體積濃度為0.1％，所述甲酸-乙腈水溶液中乙腈的體積濃度為84％；所述流動相的流速為300nL/min；