[發明專利]一種PRM檢測促黃體生成素的試劑盒及檢測方法和應用

在審

• 申請號: 202210745947.X
• 申請日: 2022-06-28
• 公開（公告）號: CN115097041A
• 公開（公告）日: 2022-09-23
• 發明（設計）人: 王翔宇;儲明星;狄冉;賀小云
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N30/06;G01N30/34;G01N30/36;G01N30/72
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 張夢澤

1.一種PRM檢測促黃體生成素的試劑盒，包括以下組分：促黃體生成素的重同位素標記肽段、質譜檢測用試劑和納升級高效液相色譜檢測用試劑。

2.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，所述促黃體生成素的重同位素標記標準肽段包括重同位素標記的第一多肽和第二多肽；所述第一多肽的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示；所述第二多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根據權利要求1或2所述的試劑盒，其特征在于，所述重同位素標記位于肽段序列C-最末端的氨基酸上。

4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述促黃體生成素的重同位素標記肽段的肽段序列C-最末端的氨基酸上的C12和N14分別用C13和N15替代。

5.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，每條促黃體生成素的所述重同位素標記肽段的濃度為200～1000fmol/ml。

6.根據權利要求1所述的試劑盒，其特征在于，還包括色譜分析柱；所述色譜分析柱包括柱管、填料和槍頭；所述填料填充于柱管內；所述槍頭套在柱管的一端；所述的柱管長度為245～255mm、外徑為355～365μm、內徑為70～80μm；所述的填料包括C18反相填料；所述C18反向相填料的粒徑為1.5～2.5μm。

7.一種基于權利要求1～6任意一項所述的試劑盒的PRM檢測促黃體生成素的方法，包括以下步驟：

1)對待測溶液進行酶解，得到含促黃體生成素的肽段，作為目標肽段；將所述目標肽段和促黃體生成素的重同位素標記肽段混合，得到混合肽段；

2)對所述混合肽段進行納升級高效液相色譜分離，得到高效液相色譜分離后的肽段；

3)對所述高效液相色譜分離后的肽段進行PRM檢測，得到質譜數據；

4)對所述質譜數據進行定量分析，得到促黃體生成素的定量結果。

8.根據權利要求7述的方法，其特征在于，步驟2)中所述納升級高效液相色譜分離的條件包括：

進樣量：2μL；

流動相：流動相A和流動相B；所述流動相A為體積濃度為0.1％的甲酸水溶液；所述流動相B為甲酸-乙腈水溶液，所述甲酸-乙腈水溶液中甲酸的體積濃度為0.1％，所述甲酸-乙腈水溶液中乙腈的體積濃度為84％；所述流動相的流速為300nL/min；

洗脫方式：梯度洗脫；

所述梯度洗脫的程序為：

0～2min，所述流動相A的體積百分含量由95％勻速降低到90％，所述流動相B的體積百分含量為由5％勻速升高到10％；

2～45min，所述流動相A的體積百分含量由90％勻速降低到70％，所述流動相B的體積百分含量為由10％勻速升高到30％；

45～55min，所述流動相A的體積百分含量由70％勻速降低到0，所述流動相B的體積百分含量為由30％勻速升高到100％；

55～60min，所述流動相B的體積百分含量維持100％。

9.根據權利要求7所述的方法，其特征在于，所述PRM檢測的條件包括：

分析時長：60min；

檢測模式：正離子；

一級質譜掃描范圍：300～1800m/z；

質譜分辨率：60,000(@m/z 200)；

AGC強度：3e6；

最大離子富集時間：200ms；

每次一級MS掃描后根據靶向肽段信息列表采集20個PRM掃描；PRM掃描參數為：分離窗口：1.6Th；質譜分辨率：30,000(@m/z 200)；AGC強度：3e6；最大離子富集時間：120ms；二級碎裂模式：HCD；正態化的碰撞能量：27。

10.權利要求1～7任意一項所述試劑盒在輔助判斷綿羊發情階段中的應用。