[發明專利]一種生產2′-巖藻糖基乳糖的乳酸乳球菌及其應用

在審

• 申請號: 202210733382.3
• 申請日: 2022-06-27
• 公開（公告）號: CN115466707A
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發明（設計）人: 路福平;鄭艷玲;李暢;李玉;程亞楠;彭則韜;翁茹茹;李慶剛
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/74;C12P19/00;C12R1/46
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發明屬于微生物代謝工程領域，涉及一種以食品級安全菌株乳酸乳球菌為研究對象，利用兩種不同途徑生產2′?巖藻糖基乳糖的方法。本發明分別在乳酸乳球菌中利用從頭合成途徑和補救途徑實現了合成2′?FL的目的，證實了利用乳酸乳球菌生產2′?FL的可行性。另外，本發明通過在發酵培養基中添加血紅素，進一步增加了2'?FL的產量，經過48h發酵后，通過從頭合成途徑，2′?FL的產量可達0.66g/L。

技術領域：

本發明屬于微生物代謝工程領域，涉及一種以食品級安全菌株乳酸乳球菌為研究對象，利用兩種不同途徑生產2′-巖藻糖基乳糖的方法。

背景技術：

母乳作為嬰兒唯一的天然食物，支持著新生兒的健康成長發育。人乳寡糖是存在于母乳中的第三大類營養物質，其含量僅次于乳糖和脂肪，在嬰幼兒的健康成長中起重要作用。HMOs(人乳寡糖)的結構非常多樣化，目前已鑒定出的寡糖就有1000多種，其中2′-FL(2′-巖藻糖基乳糖)是一種占比最大的人乳低聚糖(HMOs)產品，可高達31％。人乳寡糖作為益生元，可以調節嬰兒腸道菌群的組成，預防病原體粘附腸道、預防感染。調節新生兒的免疫系統，促進大腦發育。可以保護小腸黏膜結構、增強腸黏膜血流量，有效預防壞死性小腸結腸炎。因此在嬰幼兒奶粉中添加食品級微生物生產的HMOs可以增強新生嬰兒的免疫力、有效增強新生嬰兒的體質，也可避免大腸桿菌生產的安全性問題。

目前2′-FL(2′-巖藻糖基乳糖)的合成多采用化學法、酶法和微生物全細胞合成法。化學合成過程復雜，產率低，容易產生有毒試劑，酶法合成需要多種酶的純化，成本高，與前兩種合成方法相比，利用微生物全細胞合成法合成2′-FL更加安全、快捷且成本低，是目前最有潛力能夠實現大規模生產2′-FL的可行方法。利用大腸桿菌生產2′-巖藻糖基乳糖主要有兩條代謝途徑，分別是從頭合成途徑和補救途徑，從頭合成途徑主要是在大腸桿菌原有糖代謝途徑的基礎上，構建以葡萄糖為原料的GDP-巖藻糖的從頭合成途徑，由胞內代謝物6-磷酸果糖開始，通過磷酸甘露糖異構酶(ManA)、磷酸甘露糖變位酶(ManB)，甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶(ManC)，GDP-甘露糖-6-脫氫酶(Gmd)和GDP-巖藻糖合成酶(WcaG)的順序作用合成GDP-巖藻糖。進一步經過futC(α-(1,2)-巖藻糖基轉移酶)的作用，以GDP-巖藻糖和乳糖為底物，合成2′-巖藻糖基乳糖。補救途徑是經過巖藻糖1-激酶/GDP-巖藻糖焦磷酸化酶(Fkp)的作用，將巖藻糖轉化為GDP-巖藻糖，進一步經過futC(α-(1,2)-巖藻糖基轉移酶)的作用，以GDP-巖藻糖和乳糖為底物，合成2′-巖藻糖基乳糖。

除了研究最多的大腸桿菌，其它安全級工業微生物，例如釀酒酵母、谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌等也已經被證實可用于生產2′-FL。

對于微生物合成2′-FL的宿主還主要側重于大腸桿菌，可能是因為大腸桿菌自身擁有產磷酸核苷糖的有效途徑、有效的乳糖吸收和2′-FL的輸出途徑。然而，沒有證據表明大腸桿菌是大規模生產2′-FL的最佳生物。相比大腸桿菌，乳酸乳球菌L.lactis基因敲除、基因整合和遺傳轉化等方法相對復雜，但乳酸乳球菌耐酸性更強，能夠微氧發酵，無法降解巖藻糖和乳糖，乳酸乳球菌作為可直接應用于乳制品中的食品安全級微生物，目前還沒有用于合成2′-FL的報道。

發明內容：

為了解決上述技術問題，本發明通過遺傳改造并借助于NICE食品級表達系統，建立高效的無痕敲除和安全無抗的篩選方法，在乳酸乳球菌中通過兩種不同途徑(圖1)實現了對2′-FL(2′-巖藻糖基乳糖)的有效合成。

本發明提供的技術方案之一，是一種通過從頭合成途徑合成2′-FL的乳酸乳球菌重組菌株，所述重組菌株是在乳酸乳球菌宿主的基因組上整合磷酸甘露糖異構酶編碼基因manA、磷酸甘露糖變位酶編碼基因manB、GDP-甘露糖-4,6-脫水酶基因gmd和GDP-巖藻糖合成酶基因wcaG，同時通過質粒對甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因manC、α-(1,2)-巖藻糖基轉移酶基因futC以及乳糖透過酶基因lacF進行表達；