[發明專利]一種生產2′-巖藻糖基乳糖的乳酸乳球菌及其應用

在審

• 申請號: 202210733382.3
• 申請日: 2022-06-27
• 公開（公告）號: CN115466707A
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發明（設計）人: 路福平;鄭艷玲;李暢;李玉;程亞楠;彭則韜;翁茹茹;李慶剛
• 申請（專利權）人: 天津科技大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/74;C12P19/00;C12R1/46
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

1.一種合成2′-FL的乳酸乳球菌重組菌株，其特征在于，所述重組菌株是在乳酸乳球菌宿主的基因組上整合磷酸甘露糖異構酶編碼基因manA、磷酸甘露糖變位酶編碼基因manB、GDP-甘露糖-4,6-脫水酶基因gmd和GDP-巖藻糖合成酶基因wcaG，同時通過質粒對甘露糖-1-磷酸鳥嘌呤基轉移酶基因manC、α-(1,2)-巖藻糖基轉移酶基因futC以及乳糖透過酶基因lacF進行表達。

2.如權利要求1所述的一種合成2′-FL的乳酸乳球菌重組菌株，其特征在于，將manA、manB、gmd和wcaG基因整合到宿主染色體的尿嘧啶磷酸核糖轉移酶位點上進行表達；將manC、futC和lacF克隆到質粒pNZ8148上進行表達。

3.如權利要求1所述的一種合成2′-FL的乳酸乳球菌重組菌株，其特征在于，采用啟動子P32對manA和manB基因進行表達；采用啟動子Pnis對gmd和wcaG基因進行表達。

4.一種合成2′-FL的乳酸乳球菌重組菌株，其特征在于，所述重組菌株是在乳酸乳球菌宿主中通過質粒對雙功能巖藻糖激酶/1-磷酸巖藻糖鳥苷酸轉移酶基因fkp、α-1,2-巖藻糖基轉移酶基因futC以及乳糖透過酶基因lacF進行表達。

5.如權利要求4所述的一種合成2′-FL的乳酸乳球菌重組菌株，其特征在于，將fkp、futC和lacF克隆到質粒pNZ8148上進行表達。

6.如權利要求1或4所述的重組菌株，其特征在于，所述乳酸乳球菌宿主為乳酸乳球菌(L.lactis)NZ9000。

7.如權利要求1或4所述的重組菌株，其特征在于，所述啟動子P32，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示；

所述啟動子Pnis，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:2所示；

所述fkp基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:3所示

所述manA基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:4所示；

所述manB基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:5所示；

所述gmd基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:6所示；

所述wcaG基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:7所示；

所述upp基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:8所示；

所述futC基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:9所示；

所述lacF基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:10所示；

所述manC基因，核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:11所示。

8.權利要求1-7任意一項所述重組菌株在生產2′-FL中的應用。

9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，發酵生產2′-FL時培養基中添加血紅素。

10.如權利要求8所述的應用，其特征在于，發酵生產2′-FL的方法如下：

將重組菌種子液以1％-2％的接種量接種至含有相應底物的GM₁₇發酵培養基中，每30mL培養基中加入12μL 0.1mg/mL的Nisin溶液、30μL 50mg/mL氯霉素溶液、15μL 10mg/mL 5-氟尿嘧啶溶液，30℃、160r/min震蕩培養36-52h；

GM₁₇發酵培養基組成為，以g/L計：磷酸氫二鈉8.0-10.0，硫酸鎂1.1-1.6，氯化鈉4.0-5.0，無水乙酸鈉1.0-1.5，酵母粉4.0-5.0，蛋白胨15.0-20.0，抗壞血酸0.3-0.5，MOPS35.0-45.0，10ml/L-20ml/L的微量元素溶液，葡萄糖15.0-20.0，乳糖5.0-10.0，其余為水；調節pH至7.0左右；

或者GM₁₇發酵培養基組成為，以g/L計：磷酸氫二鈉8.0-10.0，硫酸鎂1.1-1.6，氯化鈉4.0-5.0，無水乙酸鈉1.0-1.5，酵母粉4.0-5.0，蛋白胨15.0-20.0，抗壞血酸0.3-0.5，MOPS35.0-45.0，10ml/L-20ml/L的微量元素溶液，葡萄糖15.0-20.0，巖藻糖8.0-10.0，乳糖5.0-10.0，其余為水；調節pH至7.0左右；

所述微量元素溶液組成為，以g/L計：硫酸亞鐵10.0，硫酸鋅2.2，硫酸銅1.0，硫酸錳0.38，四硼酸鈉0.02，七鉬酸銨0.1，氯化鈣2.0，其余為水。