[發明專利]酯酶pnbA-BS突變體及其在制備l-薄荷醇中的應用

有效

• 申請號: 202210729012.2
• 申請日: 2022-06-24
• 公開（公告）號: CN115109765B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發明（設計）人: 楊杜霞;劉訓;于欣君;喬菁菁;張飛龍;肖延銘;應向賢;章銀軍
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學;浙江英沃迪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P7/02;C07C35/12;C07C29/74;C07C29/76;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

本發明公開了一種酯酶pnbA?BS突變體及其在制備l?薄荷醇中的應用，所述酯酶pnbA?BS突變體是以SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第400位丙氨酸突變為脯氨酸獲得。以表達酯酶pnbA?BS突變體A400P的基因工程菌為整細胞催化劑，催化dl?乙酸薄荷酯的選擇性拆分，恒速流加方式加入底物，底物加入量可達1700mM，產物l?薄荷醇e.e.值99％，產物累積濃度可達600mM，反應時空得率可達160g/(L·d)。反應體系不添加有機溶劑，減少了化學品的使用，簡化了產物分離工藝，是一種綠色、高效、簡便的新型l?薄荷醇制備方法。

(一)技術領域

本發明屬于生物催化領域，涉及酯酶pnbA-BS突變體及其在生物酶法選擇性拆分制備光學純l-薄荷醇中的應用。

(二)背景技術

薄荷醇是世界三大香料之一，是環狀單菇烯醇中需求量最大的香料，為薄荷和薄荷精油中的主要成分。因其分子存在3個手性中心，所以它有4對8種對映異構體，分別為dl-薄荷醇、dl-異薄荷醇、dl-新薄荷醇和dl-新異薄荷醇。8種異構體中，只有l-薄荷醇具有特征的薄荷香氣和強烈的清涼作用，氣味新鮮輕快，具有興奮鎮痛、殺菌止癢、促滲透、助消化等功效，在食品、日用化工、飲料、醫藥等領域具有廣泛應用。

德之馨公司以間甲酚為原料開發了薄荷醇生成工藝。在路易斯酸催化條件下，間甲酚和丙烯反應生成百里酚，百里酚再經加氫還原得到含有8中異構體的薄荷醇混合物。后續通過精餾得到dl-薄荷醇，再經酯化dl-薄荷醇酯。dl-薄荷醇酯通過選擇性拆分得到l-薄荷醇。與化學法拆分相比，生物酶法拆分具有條件溫和、綠色環保等優點，為產業界所青睞。然而，由于缺乏同時滿足高活力和高對映體選擇性的專用酶，目前生物酶法還達不到實際應用的要求。

為了提高酯酶的l-對映體選擇性及其催化制備l-薄荷醇的效率，對源自Bacillussubtilis 168的酯酶pnbA-BS進行分子改造，獲得了在選擇性拆分dl-乙酸薄荷酯中具有嚴格l-對映體選擇性的突變體。該酯酶pnbA-BS突變體在大腸桿菌中表達，獲得基因工程菌。以該基因工程菌為催化劑，反應體系不添加有機溶劑，同時采取底物流加方式減輕底物抑制，建立了一種高效、綠色、簡便的l-薄荷醇制備方法。該方法底物加載量可達1700mM，產物濃度可達600mM，產物e.e.值99％，時空產率可達160.52g/(L·d)。

(三)發明內容

本發明目的是提供一種具有嚴格l-薄荷醇對映體選擇性的酯酶pnbA-BS突變體及其在制備l-薄荷醇中的應用。通過對酯酶pnbA-BS的半理性設計，獲得了酯酶突變體pnbA-BS-A400P，該突變體在選擇性拆分dl-乙酸薄荷酯中具有嚴格的l-對映體選擇性。以表達酯酶突變體pnbA-BS-A400P的基因工程菌濕菌體為催化劑，催化dl-乙酸薄荷酯的選擇性拆分，結合底物工程和介質工程，形成了一種綠色、高效、簡便的新型l-薄荷醇制備方法，該方法產物光學純度高，反應體系不添加有機溶劑，并且反應時空得率可達160g/(L·d)。

本發明采用的技術方案是：

本發明提供一種酯酶pnbA-BS突變體，所述酯酶pnbA-BS突變體是將SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第400位丙氨酸突變為脯氨酸獲得的，記為酯酶突變體pnbA-BS-A400P，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發明還提供一種所述酯酶pnbA-BS突變體的編碼基因，所述編碼基因的核苷酸序列為SEQ ID NO.3所示。

本發明還涉及一種含所述酯酶pnbA-BS突變體編碼基因的重組載體以及基因工程菌。所述重組載體按如下方法構建：如SEQ ID NO.3所示酯酶pnbA-BS突變體編碼基因插入pET28a載體上的Nco I和Xho I位點，得到重組載體pET28a-pnbA-BS-A400P。所述基因工程菌按如下方法構建：將重組載體pET28a-pnbA-BS-A400P導入重組菌E.coli BL21(DE3)感受態細胞中，得到所述的基因工程菌E.coli BL21(DE3)//pET28a-pnbA-BS-A400P。