[發(fā)明專利]酯酶pnbA-BS突變體及其在制備l-薄荷醇中的應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210729012.2
• 申請日: 2022-06-24
• 公開（公告）號: CN115109765B
• 公開（公告）日: 2023-10-13
• 發(fā)明（設計）人: 楊杜霞;劉訓;于欣君;喬菁菁;張飛龍;肖延銘;應向賢;章銀軍
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江工業(yè)大學;浙江英沃迪生物科技有限公司
• 主分類號: C12N9/18
• 分類號: C12N9/18;C12N15/55;C12N15/70;C12N1/21;C12P41/00;C12P7/02;C07C35/12;C07C29/74;C07C29/76;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天正專利事務所有限公司 33201
• 代理人: 黃美娟;李世玉

1.一種酯酶pnbA-BS突變體，其特征在于，所述酯酶pnbA-BS突變體是將SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第400位丙氨酸突變?yōu)楦彼岖@得的。

2.一種含權(quán)利要求1所述酯酶pnbA-BS突變體的編碼基因的重組載體，其特征在于，所述重組載體是將酯酶pnbA-BS突變體編碼基因插入pET28a載體上的Nco I和Xho I位點，得到重組載體pET28a-pnbA-BS-A400P。

3.一種權(quán)利要求2所述重組載體構(gòu)建的重組基因工程菌，其特征在于，所述重組基因工程菌是將所述重組載體導入宿主菌E.coli BL21(DE3)感受態(tài)細胞中獲得的。

4.一種權(quán)利要求1所述酯酶pnbA-BS突變體在催化dl-乙酸薄荷酯制備l-薄荷醇中的應用。

5.如權(quán)利要求4所述的應用，其特征在于所述應用為：將含酯酶pnbA-BS突變體編碼基因的工程菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)獲得的濕菌體或濕菌體制得的凍干菌體或濕菌體經(jīng)超聲破碎提取的純酶液為催化劑，以dl-乙酸薄荷酯為底物，以pH 5.0～9.0、100mM PBS緩沖液為反應介質(zhì)構(gòu)成反應體系，在10～50℃、600rpm條件下轉(zhuǎn)化反應8～24h，獲得含l-薄荷醇的反應液，反應液經(jīng)離心去除菌體并收集有機相，有機相經(jīng)分離純化，獲得l-薄荷醇。

6.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于，所述反應體系中，催化劑為純酶液時用量以蛋白含量計為1～5g/L，催化劑為凍干菌體時用量為10～30g/L，催化劑為濕菌體時用量為30～80g/L；底物加入量為100～1700mM。

7.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述濕菌體和凍干菌體按如下方法制備：將含酯酶pnbA-BS突變體編碼基因的工程菌接種至含100μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，獲得種子液，將種子液以體積濃度2％的接種量接種至新鮮的含100μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD₆₀₀為0.5～0.7，再加入終濃度為0.5mM的IPTG，24℃誘導16h，獲得誘導培養(yǎng)液，再將誘導培養(yǎng)液于4℃和8000rpm下離心10min，棄去上清液，收集濕菌體；濕菌體經(jīng)真空冷凍干燥24h，獲得凍干菌體。

8.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述純酶液按如下方法制備：(1)將濕菌體以1g：20mL的比例加入pH 8.1、50mM的Tris-HCl緩沖液中，在125W、工作2s、間隔6s的條件下超聲破碎15min，離心，取上清即為粗酶液；(2)取粗酶液加至DEAE離子交換柱中，手動上樣，用Buffer A平衡后，依次用體積比9:1，4:1，3:1以及1:1的Buffer A和Buffer B的混合液作為洗脫液洗脫雜蛋白和目的蛋白，洗脫速率3.0mL/min，每個洗脫液洗脫1.5個柱體積，收集體積比4:1的洗脫液對應的流出液，流出液用截留分子量為10kDa超濾管濃縮脫鹽，收集截留液；(3)將步驟(2)截留液上樣于凝膠過濾層析柱，填料為丙烯葡聚糖凝膠S-200，用50mM，pH8.1的Tris-HCl緩沖液作為洗脫液；洗脫速率為0.5mL/min，控制壓力在0.42～0.47Mpa間保持穩(wěn)定；收集具有酯酶活力的流出液并用截留分子量為10kDa的超濾管進行濃縮，取截留液即得到酯酶pnbA-BS突變體純酶液；所述Buffer A：50mM的Tris-HCl緩沖液，pH 8.1；所述Buffer B：1M的NaCl溶于50mM的Tris-HCl緩沖液，pH 8.1。

9.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于在反應過程中底物一次加入或者恒速流加方式加入；當?shù)孜锛虞d量小于1000mM時，在反應開始時一次加入，反應時間8～14h；當?shù)孜锛虞d量為1000～1700mM，底物按恒速流加方式進行：初始底物濃度為250mM，剩余底物通過恒速微量泵注入到反應體系中，恒速流加時間為10h，底物流加完成后再繼續(xù)反應4～14h。

10.如權(quán)利要求5所述的應用，其特征在于所述反應液分離純化方法為：所得反應液在12000rpm下離心10min去除菌體，取上層有機相加適量無水硫酸鈉進行除水處理，然后在12000rpm下再離心1min；取上層有機相經(jīng)有機膜過濾去除菌體蛋白；濾液進行硅膠柱層析，填料為300目硅膠，濕法上樣，流動相為體積比1:20的乙酸乙酯：正己烷，流速為1.5mL/min，洗脫4個柱體積，收集l-薄荷醇洗脫峰，用減壓蒸餾除去溶劑，到產(chǎn)物l-薄荷醇。