[發(fā)明專利]一種利用CsWRKY43干擾以提高柑橘潰瘍病抗性的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210724641.6
• 申請(qǐng)日: 2022-06-24
• 公開（公告）號(hào): CN115058449B
• 公開（公告）日: 2023-05-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李強(qiáng);喻奇緣;秦秀娟;傅佳;何永睿;陳善春;龍琴
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 西南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/84
• 分類號(hào): C12N15/84;C12N15/66;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/46
• 代理公司: 成都行之智信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51256
• 代理人: 陳銳

本發(fā)明公開了一種利用CsWRKY43干擾以提高柑橘潰瘍病抗性的方法，采用RNA干擾(RNAi)降低柑橘屬植物中CsWRKY43的轉(zhuǎn)錄水平，其中，CsWRKY43編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；具體包括以下步驟：(1)克隆柑橘CsWRKY43編碼基因的RNAi片段；(2)構(gòu)建CsWRKY43基因片段的干擾表達(dá)載體；(3)干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化柑橘，得到轉(zhuǎn)基因植株。本發(fā)明通過克隆柑橘CsWRKY43編碼基因的RNAi片段，構(gòu)建干擾載體，然后轉(zhuǎn)化柑橘，得到的轉(zhuǎn)基因植株潰瘍病病斑面積可最大降低至現(xiàn)有柑橘的64％，病情指數(shù)可最大降低至現(xiàn)有柑橘的61％，能夠顯著的減輕潰瘍病的發(fā)病程度。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及分子生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體而言，涉及一種利用CsWRKY43干擾以提高柑橘潰瘍病抗性的方法。

背景技術(shù)

近年來，我國柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅猛，逐漸成為南方山區(qū)的主要經(jīng)濟(jì)支柱。然而，柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展卻飽受柑橘潰瘍病等病害的制約。柑橘潰瘍病(Citrus?bacterial?canker，CBC)是由地毯草黃單胞桿菌柑橘亞種(Xanthomonas?citri?subsp.Citri，Xcc)引起的細(xì)菌性病害，其危害當(dāng)前大多數(shù)主栽柑橘品種。因此，加強(qiáng)對(duì)柑橘潰瘍病防控研究是柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的迫切需求。

柑橘潰瘍病的傳統(tǒng)防控手段(病樹焚燒和農(nóng)藥使用等)需要投入大量人力和物力，且會(huì)造成巨大環(huán)境危害。因此，柑橘潰瘍病防治更多寄希望于培育抗病新種質(zhì)。分子育種由于可定向、高效培育抗病新種質(zhì)，目前得到快速發(fā)展和廣泛應(yīng)用。近年來，通過生物技術(shù)手段已獲得一些抗?jié)儾〉母涕儋Y源，例如轉(zhuǎn)柞蠶抗菌肽D基因的錦橙、新會(huì)橙、臍橙株系；過表達(dá)CsBZIP40的晚錦橙株系；基因定點(diǎn)編輯柑橘潰瘍病感病基因CsLOB1啟動(dòng)子獲得的對(duì)柑橘潰瘍病抗性提高的植株等。但優(yōu)質(zhì)候選基因仍然匱乏，且功能和作用機(jī)制研究不深，致使多基因協(xié)同對(duì)抗?jié)儾∵€難以實(shí)現(xiàn)，制約了柑橘抗?jié)儾》肿佑N的發(fā)展。因此，亟待有針對(duì)性地挖掘更多與柑橘潰瘍病緊密相關(guān)的基因，深入解析其功能和機(jī)制，用于抗?jié)儾》肿佑N。

自1996年WRKY轉(zhuǎn)錄因子被首次報(bào)道在應(yīng)對(duì)病原體方面發(fā)揮一定的調(diào)控作用以來，越來越多的研究聚焦于WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物抗病中的功能。不同的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物免疫防御反應(yīng)中功能各異。利用WRKY基因進(jìn)行抗病分子育種具有重大的潛力。但是，植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員眾多，而且各成員的功能和機(jī)制也多種多樣，利用WRKY進(jìn)行抗病分子育種的嘗試還不多，尚沒有利用RNAi介導(dǎo)的WRKY沉默提高柑橘對(duì)柑橘潰瘍病的抗性研究和應(yīng)用。

研究中發(fā)現(xiàn)，受Xcc誘導(dǎo)后CsWRKY43在感病品種晚錦橙中表達(dá)量總體呈上升趨勢(shì)，與之相反，在抗病品種四季橘中CsWRKY43的表達(dá)量呈下降趨勢(shì)，暗示CsWRKY43是潰瘍病的一個(gè)感病基因。CsWRKY43可以通過正調(diào)控下游的活性氧清除相關(guān)基因的表達(dá)降低植株的活性氧水平，活性氧在植物抗病過程中有積極的調(diào)控作用，所以推測(cè)CsWRKY43干擾可能降低活性氧清除相關(guān)基因的表達(dá)進(jìn)而增加植株的活性氧水平和潰瘍病抗性。

有鑒于此，特提出本申請(qǐng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為提高柑橘對(duì)潰瘍病的抗性，提供一種利用CsWRKY43干擾以提高柑橘潰瘍病抗性的方法，該方法通過將CsWRKY43編碼基因的干擾載體整合到柑橘中，降低CsWRKY43的轉(zhuǎn)錄水平，能夠顯著提高柑橘對(duì)潰瘍病的抗性，并且不影響轉(zhuǎn)基因植株的表型。

本發(fā)明通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種利用CsWRKY43干擾以提高柑橘潰瘍病抗性的方法，所述方法為采用RNA干擾(RNAi)降低柑橘屬植物中CsWRKY43的轉(zhuǎn)錄水平，其中，CsWRKY43編碼基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；具體包括以下步驟：

(1)克隆柑橘CsWRKY43編碼基因的RNAi片段；

(2)構(gòu)建CsWRKY43基因片段的干擾表達(dá)載體；