[發(fā)明專利]一種利用CsWRKY43干擾以提高柑橘潰瘍病抗性的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 202210724641.6 | 申請(qǐng)日： | 2022-06-24 |
| 公開（公告）號(hào)： | CN115058449B | 公開（公告）日： | 2023-05-16 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 李強(qiáng);喻奇緣;秦秀娟;傅佳;何永睿;陳善春;龍琴 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 西南大學(xué) |
| 主分類號(hào)： | C12N15/84 | 分類號(hào)： | C12N15/84;C12N15/66;C12N15/29;A01H5/00;A01H6/46 |
| 代理公司： | 成都行之智信知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 51256 | 代理人： | 陳銳 |
| 地址： | 400700*** | 國(guó)省代碼： | 重慶;50 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 利用 cswrky43 干擾 提高 柑橘 潰瘍 抗性 方法 | ||
1.一種利用CsWRKY43干擾以提高晚錦橙潰瘍病抗性的方法，其特征在于，所述方法為采用RNAi降低晚錦橙中CsWRKY43的轉(zhuǎn)錄水平，CsWRKY43基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示；
包括以下步驟：
（1）克隆晚錦橙CsWRKY43編碼基因的RNAi片段，RNAi片段核苷酸序列如SEQ?ID?NO：2所示；
（2）構(gòu)建CsWRKY43基因片段的干擾表達(dá)載體：
（2.1）將步驟（1）中CsWRKY43編碼基因的RNAi片段分兩組，第一組用SwaⅠ和AscⅠ雙酶切，第二組用BamHⅠ和XbaⅠ雙酶切；（2.2）將酶切回收的兩組片段同時(shí)連接到pUC-RNAi載體，得到中間載體pUC-RNAi-CsWRKY43；（2.3）將中間載體pUC-RNAi-CsWRKY43和pLGNe超量表達(dá)載體用KpnⅠ和SalⅠ分別雙酶切；（2.4）將中間載體含有RNAi片段的酶切產(chǎn)物連接到pLGNe載體上；（2.5）連接轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞，提取質(zhì)粒，得到干擾表達(dá)載體pLGNe-CsWRKY43-RNAi；
（3）干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化晚錦橙，得到轉(zhuǎn)基因植株。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用CsWRKY43干擾以提高晚錦橙潰瘍病抗性的方法，其特征在于，步驟（1）中，晚錦橙CsWRKY43編碼基因的RNAi片段的克隆方法為：提取晚錦橙總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板采用高保真酶PCR擴(kuò)增得到CsWRKY43編碼基因的RNAi片段。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種利用CsWRKY43干擾以提高晚錦橙潰瘍病抗性的方法，其特征在于，步驟（1）中，PCR擴(kuò)增所采用的引物為CsWRKY43-RNAi-F和CsWRKY43-RNAi-R，其核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO：3和SEQ?ID?NO：4所示。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種利用CsWRKY43干擾以提高晚錦橙潰瘍病抗性的方法，其特征在于，步驟（3）中，干擾表達(dá)載體轉(zhuǎn)化晚錦橙的方法為：通過電擊法將干擾表達(dá)載體質(zhì)粒導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌，再用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化晚錦橙外植體，遺傳轉(zhuǎn)化后的外植體細(xì)胞再經(jīng)離體培養(yǎng)、染色鑒定、嫁接、PCR驗(yàn)證和qRT-PCR驗(yàn)證后得到轉(zhuǎn)基因植株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的一種利用CsWRKY43干擾以提高晚錦橙潰瘍病抗性的方法，其特征在于，步驟（3）得到轉(zhuǎn)基因植株后，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)，判定CsWRKY43干擾與晚錦橙潰瘍病抗性的相關(guān)性。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種利用CsWRKY43干擾以提高晚錦橙潰瘍病抗性的方法，其特征在于，對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行抗性評(píng)價(jià)前，通過PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株，采用的引物為ID-CsWRKY43-F和ID-CsWRKY43-R，核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.5和SEQ?ID?NO.6所示。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的一種利用CsWRKY43干擾以提高晚錦橙潰瘍病抗性的方法，其特征在于，?PCR驗(yàn)證后，用qRT-PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因植株中CsWRKY43的轉(zhuǎn)錄水平，目的基因檢測(cè)采用的引物為RT-CsWRKY43-F和RT-CsWRKY43-R，核苷酸序列分別如SEQ?ID?NO.7和SEQ?IDNO.8所示。
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