[發明專利]具有成型區域的吸除材料、其制造方法及其用途

在審

• 申請號: 202210722312.8
• 申請日: 2022-06-24
• 公開（公告）號: CN115524182A
• 公開（公告）日: 2022-12-27
• 發明（設計）人: I·斯皮;J·布雷瑟爾;A·高;M·庫伊佩爾;M·P·W·范登布加爾德
• 申請（專利權）人: FEI公司
• 主分類號: G01N1/28
• 分類號: G01N1/28;G01N1/42;F26B5/16
• 代理公司: 中國專利代理(香港)有限公司 72001
• 代理人: 鄒松青;司昆明

本發明描述了一種包括成型區域的吸除材料，所述成型區域具有被配置為至少部分地突出到由樣品網格的保持器的邊緣形成的邊界內形成的空間中的部分。還描述了用于制作此類輪廓的方法和用于制作所述輪廓的部件。還提供通過使所述成型吸除材料與經過所述樣品網格保持器的所述樣品網格相關聯來從樣品網格移除多余液體的方法。還描述了包括保持所述樣品網格保持器的裝置、保持吸除紙的裝置以及將所述兩者結合在一起的裝置的系統。

細胞和結構生物學研究中采用了許多技術，這些技術在樣品制備和分析中采用低溫條件。不完全的示例是低溫電子顯微鏡（cryo-EM）、單粒子分析（SPA）、低溫電子斷層掃描（cryo-ET）和微電子衍射（MicroED）。

需要在含水液體（例如水、電解質、細胞液、血漿等）中儲存和研究的生物樣本（例如細胞、細胞成分、單細胞生物體等）在CPM中進行檢查時會面臨巨大的挑戰，因為：

- 引入到CPM的（準）真空環境中的含水液體將開始除氣/沸騰，從而傾向于使樣本劣化；

- 為了防止此情況，樣品（樣本+含水液體）在被引入此真空之前可以首先被冷凍；

- 然而，為了防止由（尖銳的）冰晶的形成導致的對樣本的損害，此類冷凍一般必須非常快速地進行，目的是實現樣品玻璃化（固化成無定形的玻璃樣相）而沒有顯著的冰結晶。

為了便于此類玻璃化——也為了允許在透射型CPM（如TEM）中研究樣品——樣品應相對較薄（片狀），但人們仍然應能夠通過其邊緣支撐它（以便所采用的支撐裝置對光束穿透沒有顯著影響）。為此，通常使用網格狀保持器（諸如所謂的TEM Autogrid?），多孔膜（諸如所謂的“多孔碳膜”）橫跨此保持器，在此多孔膜的孔中可以容納少量樣品（通過表面張力效應）。

在此類技術的樣品制備階段，通常將包含樣品的溶液施加到網格并且在分析前將樣品玻璃化。玻璃化形成一種無定形固體，對樣品結構幾乎沒有損害，并且是細胞和結構生物學研究的關鍵技術，其中樣品被如此快速地冷卻，以至于周圍的水分子沒有時間結晶。

存在許多有助于制備用于低溫分析的樣品的裝置。一種此類裝置是Vitrobot（Thermofisher Scientific,Inc.）。WO 02/077612 A1教導了此類裝置。

在通常的操作模式中，將含有樣品的溶液施加到薄網格上，吸除多余液體，將樣品玻璃化，然后將裝有玻璃化樣品的網格裝載（夾入）到保持器（諸如所謂的AutoGrid?）中，準備進行顯微分析。例如，此技術用于徠卡柱塞裝置，其中使用平濾紙在裸露的未夾住的網格上進行單面吸除。替代地，將樣品網格預裝到保持器上，然后加入樣品，并且用針將其展開成薄層，并且將樣品玻璃化。此技術只能覆蓋很小的區域。此外，它并不適用于所有類型的樣品，諸如細胞和晶體。

這兩種方法都有各自的問題。例如，對于在網格被夾到保持器之前將樣品添加到網格的方法，隨后是在LN2條件下將具有冷凍樣品的網格夾到保持器的相對困難的步驟。因此，在這些方法中，在玻璃化之前將網格預裝在保持器上會對用戶更有幫助。

然而，對于在玻璃化之前樣品和網格已經與保持器相關聯的方法，本發明人已經發現，組合的網格和保持器的最終幾何形狀呈現不期望的情況，由此使得從樣品網格適當吸除任何多余液體變得不一致。

在這方面，將網格（例如樣品支撐盤，通常直徑約為3 mm，厚度為10 μm至40 μm）夾在保持器（例如autogrid通常地具有在約2.7 mm直徑的網格上的主（正面）開口）具有一個平坦表面，所述平坦表面相對于保持器的外部正面表面平面凹進約100 μm。網格的另一個平面表面和保持器的背面外表面平面之間的距離可以接近300 μm。圖1A和圖1B描述了裝載到保持器的樣品網格的典型布置的此類配置（1=保持器；2=樣品網格；3=樣品網格的正面；4=樣品網格的后側）。