[發(fā)明專(zhuān)利]一株生產(chǎn)高純度L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210718319.2
• 申請(qǐng)日: 2022-06-23
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115058377A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-09-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 翟征遠(yuǎn);史蘇安;趙照兒;郝彥玲;王淳
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N1/21
• 分類(lèi)號(hào): C12N1/21;C12N15/74;C12N15/90;C12N15/53;C12N15/61;C12P7/56;C12R1/25
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本發(fā)明涉及一株生產(chǎn)高純度L?乳酸的植物乳桿菌工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用，所述植物乳桿菌工程菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC No.M 2022751，保藏日期為2022年5月30日，利用自殺載體同源重組雙交換方法敲除了D?乳酸脫氫酶基因ldhD和乳酸消旋酶基因larA，利用本發(fā)明所述方法構(gòu)建的菌株可生產(chǎn)純度為99.84％的L?乳酸。本發(fā)明提供了通過(guò)代謝通路改造使植物乳桿菌生產(chǎn)高純度L?乳酸的有效方法，適用于開(kāi)發(fā)植物乳桿菌作為高純度L?乳酸生產(chǎn)菌種。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及到一株生產(chǎn)高純度 L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用。

背景技術(shù)

L-乳酸作為酸味劑、pH調(diào)節(jié)劑、抑菌劑及保鮮劑等廣泛應(yīng)用于食品行業(yè)。同時(shí)，以L-乳酸為原料合成聚L乳酸是理想的石油基塑料替代品，具有良好的生物相容性，在食品包裝、農(nóng)業(yè)和醫(yī)療領(lǐng)域都有良好的應(yīng)用前景。而L-乳酸的純度是合成聚L乳酸的關(guān)鍵因素，L-乳酸的生成成本直接影響聚L-乳酸的價(jià)格和應(yīng)用潛力。我國(guó)農(nóng)產(chǎn)品加工業(yè)每年產(chǎn)生大量諸如秸稈、薯渣的復(fù)雜生物質(zhì)廢渣，可作為發(fā)酵法生產(chǎn)L-乳酸的廉價(jià)原料，降低其生產(chǎn)成本。

植物乳桿菌在自然界生態(tài)位廣泛、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)，是最有潛力利用復(fù)雜生物質(zhì)廢渣生產(chǎn)乳酸的菌種之一。然而大多數(shù)植物乳桿菌菌株產(chǎn)生D-乳酸和 L-乳酸兩種構(gòu)型的乳酸，與市場(chǎng)對(duì)高純度L-乳酸的需求相悖。

因此，如何能夠低成本的獲得高純度L-乳酸，是一個(gè)需要解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

為了克服現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明提出了一株生產(chǎn)高純度L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株及其構(gòu)建和應(yīng)用。所述植物乳桿菌工程菌株可以淀粉類(lèi)生物質(zhì)廢料為底物生產(chǎn)L-乳酸，可同時(shí)達(dá)到提高淀粉類(lèi)生物質(zhì)廢料處理經(jīng)濟(jì)效益和降低L-乳酸生產(chǎn)成本的效果。

本發(fā)明的目的是這樣實(shí)現(xiàn)的：

一株生產(chǎn)高純度L-乳酸的植物乳桿菌Lactiplantibacillus plantarum工程菌株CAUH2-2，所述工程菌株保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為 CCTCC No.M2022751，保藏日期為2022年5月30日。

進(jìn)一步的，所述植物乳桿菌工程菌株為敲除了D-乳酸脫氫酶基因ldhD和乳酸消旋酶基因larA的植物乳桿菌。

進(jìn)一步的，所述D-乳酸脫氫酶基因ldhD的基因序列為 NCBI-A1F92_08525，所述乳酸消旋酶基因larA的基因序列為 NCBI-A1F92_00415。

本發(fā)明的另一方面：

所述生產(chǎn)高純度L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，利用自殺載體同源重組雙交換方法敲除D-乳酸脫氫酶基因ldhD和乳酸消旋酶基因larA，并且基因敲除過(guò)程中，在篩選與培養(yǎng)用培養(yǎng)基中補(bǔ)充D-乳酸。

進(jìn)一步的，所述生產(chǎn)高純度L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株的構(gòu)建方法，步驟如下：

步驟1，D型乳酸脫氫酶基因ldhD敲除突變體的構(gòu)建：

S11，構(gòu)建攜帶有l(wèi)dhD基因敲除同源臂的自殺載體

從植物乳桿菌的基因組中擴(kuò)增ldhD基因敲除所需兩段同源臂armA1和 armB1，兩段同源臂armA1和armB1的特異性引物，armA1上游、下游引物序列分別如SEQ ID No.1和SEQID No.2所示，armB1上游、下游引物序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；兩端同源臂分別通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增，再使用SOE PCR方法將同源交換臂片段armA1和armB1連接，形成ldhD基因融合同源臂片段；

使用EcoRI和BamHI對(duì)質(zhì)粒pUC19e進(jìn)行雙酶切，形成粘性末端，與經(jīng)過(guò)同樣雙酶切的ldhD基因融合同源臂片段連接，形成重組質(zhì)粒pUCldhD；