[發明專利]一株生產高純度L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株及其構建和應用

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• 申請號: 202210718319.2
• 申請日: 2022-06-23
• 公開（公告）號: CN115058377A
• 公開（公告）日: 2022-09-16
• 發明（設計）人: 翟征遠;史蘇安;趙照兒;郝彥玲;王淳
• 申請（專利權）人: 中國農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;C12N15/90;C12N15/53;C12N15/61;C12P7/56;C12R1/25
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1.一株生產高純度L-乳酸的植物乳桿菌Lactiplantibacillus plantarum工程菌株，其特征在于，所述植物乳桿菌工程菌株為敲除了D-乳酸脫氫酶基因ldhD和乳酸消旋酶基因larA的植物乳桿菌。

2.根據權利要求1所述的生產高純度L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株，其特征在于，所述D-乳酸脫氫酶基因ldhD的基因序列為NCBI-A1F92_08525，所述乳酸消旋酶基因larA的基因序列為NCBI-A1F92_00415。

3.根據權利要求1或2所述的生產高純度L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株，其特征在于，其保藏編號為CCTCC No.M2022751。

4.如權利要求1～3任一項所述生產高純度L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株的構建方法，其特征在于，利用自殺載體同源重組雙交換方法敲除D-乳酸脫氫酶基因ldhD和乳酸消旋酶基因larA，并且基因敲除過程中，在篩選與培養用培養基中補充D-乳酸。

5.根據權利要求4所述生產高純度L-乳酸的植物乳桿菌工程菌株的構建方法，其特征在于，步驟如下：

步驟1，D型乳酸脫氫酶基因ldhD敲除突變體的構建：

S11，構建攜帶有ldhD基因敲除同源臂的自殺載體

從植物乳桿菌的基因組中擴增ldhD基因敲除所需兩段同源臂armA1和armB1，兩段同源臂armA1和armB1的特異性引物，armA1上游、下游引物序列分別如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示，armB1上游、下游引物序列分別如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示；兩端同源臂分別通過PCR進行擴增，再使用SOE PCR方法將同源交換臂片段armA1和armB1連接，形成ldhD基因融合同源臂片段；

使用EcoRI和BamHI對質粒pUC19e進行雙酶切，形成粘性末端，與經過同樣雙酶切的ldhD基因融合同源臂片段連接，形成重組質粒pUCldhD；

S12，制備發生一次同源重組的植物乳桿菌工程菌株

利用S11構建的重組質粒pUCldhD，電轉化植物乳桿菌感受態細胞，獲得發生一次同源重組的植物乳桿菌工程菌株；

S13，制備ldhD基因缺失型植物乳桿菌

將S12制備得到的發生一次同源重組的植物乳桿菌工程菌株，于含有D-乳酸的培養基中紅反復傳代，通過影印法篩選發生兩次同源重組的植物乳桿菌；

將發生兩次同源重組的植物乳桿菌在含有D-乳酸培養基中培養，獲得的菌落以PCR方法鑒定，從而獲得ldhD基因缺失型植物乳桿菌；

步驟2，ldhD基因、larA基因雙基因敲除型突變體的構建

S21，構建攜帶有larA基因敲除同源臂的自殺載體

從植物乳桿菌的基因組中擴增larA基因敲除所需兩段同源臂armA2和armB2，兩段同源臂armA2和armB2的特異性引物，armA2上游、下游引物序列分別如SEQ ID No.5和SEQ IDNo.6所示，armB2上游、下游引物序列分別如SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示；兩端同源臂分別通過PCR進行擴增，再使用SOE PCR方法將同源交換臂片段armA2和armB2連接，形成larA基因融合同源臂片段；

使用EcoRI和BamHI對質粒pUC19e進行雙酶切，形成粘性末端，與經過同樣雙酶切的larA基因融合同源臂片段連接，形成重組質粒pUClarA；

S22，制備發生一次同源重組的植物乳桿菌工程菌株

利用S21構建的重組質粒pUClarA，電轉化植物乳桿菌感受態細胞，獲得發生一次同源重組的植物乳桿菌工程菌株；

S23，制備ldhD基因、larA基因雙基因敲除型突變體

將S22制備得到的發生一次同源重組的植物乳桿菌工程菌株，于含有D-乳酸的培養基中紅反復傳代，通過影印法篩選發生兩次同源重組的植物乳桿菌；

將發生兩次同源重組的植物乳桿菌在含有D-乳酸培養基中培養，獲得的菌落以PCR方法鑒定，從而獲得ldhD基因、larA基因雙基因敲除型植物乳桿菌。