[發明專利]一種索馬魯肽的制備方法

有效

• 申請號: 202210716714.7
• 申請日: 2022-06-23
• 公開（公告）號: CN114790474B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 曹海燕;林兆生;董欣;張海波;王含
• 申請（專利權）人: 北京惠之衡生物科技有限公司;吉林惠升生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36
• 代理公司: 北京開陽星知識產權代理有限公司 11710
• 代理人: 呂亞會

本發明涉及一種索馬魯肽的制備方法，所述制備方法包括從發酵菌體中收集包涵體、包涵體處理制備融合蛋白、融合蛋白經過酶切及純化處理得索馬魯肽前體、索馬魯肽前體與側鏈和二肽連接得索馬魯肽的步驟。本發明制備的索馬魯肽前體融合蛋白使用一種突變EK酶進行酶切處理。本發明提供的制備方法同時結合高表達的重組工程菌和高活性、高收率的突變EK酶，不僅能夠顯著提升索馬魯肽的生產效率，且顯著降低索馬魯肽的生產成本。

技術領域

本發明涉及多肽藥物制備領域，尤其涉及一種索馬魯肽的制備方法。

背景技術

隨著社會經濟的發展，人民生活水平逐步提高，人們的飲食結構發生了巨大變化，也導致肥胖發生率增加，并進一步導致糖尿病患者人數的急劇增加。據統計數據顯示，我國糖尿病患者人數超過1億，同時還有超過1.5億的隱形糖尿病前期患者。糖尿病已經成為第三大慢性疾病。

近年來，胰高血糖素樣肽-1（glucagon-likepeptide-1，GLP-1）受體激動劑（GLP-1RAs）逐漸成為治療T2DM的研究熱點。目前，市場上用于治療糖尿病的GLP-1藥物主要有艾塞那肽、阿必魯肽、度拉糖肽、利拉魯肽和索馬魯肽（又名司美魯肽，Semaglutide）。

索馬魯肽（Semaglutide）是由丹麥諾和諾德公司研制的一種新一代GLP-1類似物，是一種長效GLP-1制劑（周制劑）。索馬魯肽與人GLP-1同源性較高，其以天然人GLP-1（7-37）分子為基礎，通過替換第8位氨基酸（丙氨酸替換為α-氨基丁酸）和第34位氨基酸（賴氨酸替換為精氨酸），同時在第26位賴氨酸通過間隔基連接C18脂肪二酸側鏈得到。索馬魯肽通過上述結構調整，實現了可抵抗二肽基肽酶4降解，并與白蛋白結合而延長體內半衰期，實現一周給藥一次的長效效果。目前，諾和諾德也已經推出了索馬魯肽的口服制劑，并且，除了治療糖尿病外，FDA已批準索馬魯肽用于減肥適應癥。

由于索馬魯肽主鏈末端有二肽His-Aib（Aib為非天然氨基酸），因此，通常采用將索馬魯肽重組發酵表達其余29個氨基酸（簡稱索馬魯肽前體），再通過化學合成連接上述二肽His-Aib，并連接側鏈進行制備。目前，對索馬魯肽的研究主要集中在其結構與制劑中，對于具有高表達潛力的表達載體、重組工程菌以及發酵方法等研究較少。

本發明申請人在前期研究中，在CN113502296A中提供了一種高表達司美格魯肽（索馬魯肽）前體重組工程菌及其構建方法，通過利用大腸桿菌原核表達體系，設計包含索馬魯肽前體的融合蛋白結構，并將其插入表達載體中，以融合蛋白包涵體形式表達，從而實現了索馬魯肽前體的穩定高表達。同時申請人在CN113502310A提供了一種高密度發酵制備司美魯肽前體的方法，其在得到能夠穩定高表達索馬魯肽前體的重組工程菌的基礎上，通過在基礎發酵培養基的基礎上調整，能夠顯著提高菌體發酵表達量，降低生產成本。

同時，在大腸桿菌（E.coli）中，許多哺乳動物蛋白被表達為融合蛋白，其必須被切割以釋放成熟的活性蛋白。為了實現該目的，就需要使用工具酶，優選直接在連接處切割且在產物上不留下額外氨基酸的工具酶。由于腸激酶的底物酶切位點序列具有高度的特異性，使得其成為基因工程融合蛋白表達后修飾過程中一個極其有用的工具酶而被廣泛應用。在CN113502296A中提供的高表達司美格魯肽（索馬魯肽）前體的重組工程菌中，使用的即是腸激酶酶切位點。