[發(fā)明專利]一種索馬魯肽的制備方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210716714.7
• 申請日: 2022-06-23
• 公開（公告）號: CN114790474B
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 曹海燕;林兆生;董欣;張海波;王含
• 申請（專利權(quán)）人: 北京惠之衡生物科技有限公司;吉林惠升生物制藥有限公司
• 主分類號: C07K1/36
• 分類號: C07K1/36
• 代理公司: 北京開陽星知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11710
• 代理人: 呂亞會

1.一種索馬魯肽的制備方法，其特征在于，所述制備方法至少包括如下步驟：

（1）從發(fā)酵菌體中收集包含索馬魯肽前體融合蛋白的包涵體，包涵體溶解變性并純化，得到包含索馬魯肽前體融合蛋白的溶液，所述索馬魯肽前體融合蛋白的氨基酸序列如SEQID No.5或SEQ ID No.6所示；

（2）包含索馬魯肽前體融合蛋白的溶液經(jīng)過酶切、純化處理，得到索馬魯肽前體，所述酶切使用突變EK酶，所述突變EK酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

（3）索馬魯肽前體連接側(cè)鏈和二肽，得到所述索馬魯肽。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟（1）中，收集包涵體的方法為：將發(fā)酵菌體懸浮并勻漿，高壓均質(zhì)機破碎菌體，離心收集包涵體粗沉淀并洗滌后，獲得所述包涵體。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟（1）中，收集包涵體的方法為：將發(fā)酵菌體按照1g使用6-12 mL純化水的比例懸浮并勻漿，高壓均質(zhì)機800-1000 bar破碎菌體，離心獲得包涵體粗沉淀，將包涵體粗沉淀用pH2-9的緩沖液洗滌2-5次后獲得所述包涵體。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中的任一項所述的制備方法，其特征在于，在所述步驟（1）中，所述包涵體溶解變性的方法包括：使用變性液進行包涵體溶解，溶解后調(diào)節(jié)pH至7.0-12.0，繼續(xù)攪拌至包涵體完全溶解；溶解后的變性液經(jīng)過濾澄清后，使用Tris溶液稀釋進行復(fù)性，得到所述包含索馬魯肽前體融合蛋白的溶液；

所述變性液組成為：15-25mM Tris和2-8 M尿素。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）為：將包含索馬魯肽前體融合蛋白的溶液調(diào)節(jié)pH至8-9，按照每克蛋白添加1-3 mg的EK酶的比例添加所述突變EK酶進行酶切，酶切后的樣品進行離子交換層析、酸析、復(fù)溶和反相層析純化，得到索馬魯肽前體溶液。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的制備方法，其特征在于，步驟（2）為：將包含索馬魯肽前體融合蛋白的溶液調(diào)節(jié)pH至8-9，按照每克蛋白添加1-3 mg的EK酶的比例加入突變EK酶混合均勻，在室溫下進行酶切14-20 h，酶切后的樣品進行離子交換層析、酸析、復(fù)溶、反相層析純化，得到索馬魯肽前體溶液。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，在步驟（3）中，所述索馬魯肽前體連接側(cè)鏈和二肽的方法包括：將索馬魯肽前體與tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯進行反應(yīng)，反應(yīng)完成后利用緩沖液稀釋，并將偶聯(lián)側(cè)鏈產(chǎn)物與二肽活化酯進行二肽偶聯(lián)，然后脫保護，得到所述索馬魯肽。

8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述索馬魯肽前體與tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯的摩爾比為1:(1-2)；活化酯反應(yīng)的pH值為8-12。

9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的制備方法，其特征在于，所述二肽活化酯與偶聯(lián)側(cè)鏈產(chǎn)物的摩爾比為(1-6):1，兩者偶聯(lián)后，經(jīng)反相層析純化、濃縮、酸析，再進行脫保護。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的制備方法，其特征在于，在步驟（3）中，所述索馬魯肽前體連接側(cè)鏈和二肽的方法包括：

利用有機溶劑稀釋索馬魯肽前體溶液，按照索馬魯肽前體與tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯的摩爾比為1:(1-2)加入10-100 mg/mL的tBuO-Ste-Glu(AEEA-AEEA-OH)-OtBu活化酯的溶液，控制反應(yīng)pH值為8-12進行反應(yīng)，反應(yīng)完成后按照偶聯(lián)側(cè)鏈產(chǎn)物與二肽活化酯的摩爾比為1:(1-6)加入二肽活化酯完成二肽偶聯(lián)，反應(yīng)完成后經(jīng)反相層析純化、濃縮、酸析，再利用三氟乙酸溶解沉淀進行脫保護，得到所述索馬魯肽。