[發明專利]PCR擴增引物對及其應用

在審

• 申請號: 202210706287.4
• 申請日: 2022-06-21
• 公開（公告）號: CN114990242A
• 公開（公告）日: 2022-09-02
• 發明（設計）人: 張鳳;祁騰;張清平;王靜;唐甜;舒希;朱旭
• 申請（專利權）人: 重慶市天友乳業股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/07
• 代理公司: 重慶西南華渝專利代理有限公司 50270
• 代理人: 馮曉超

本發明屬于細菌檢測技術領域，具體涉及一種PCR擴增引物對及其應用，尤其適用于對耐熱芽孢桿菌的檢測。該PCR擴增引物對的上游引物包含如SEQ ID NO：1所示序列，下游引物包含如SEQ ID NO：2所示序列。該PCR擴增引物對在檢測耐熱芽孢桿菌時，特異性強，可以有效與耐熱芽孢桿菌發生特異性擴增；而且基于該PCR擴增引物對的實時熒光PCR擴增檢測方法檢測耐熱芽孢桿菌時，90min左右即可完成檢測，檢測時間短；檢測牛乳中耐熱芽孢桿菌的檢測限可以達到11CFU/mL，靈敏度高。

技術領域

本發明屬于細菌檢測技術領域，具體涉及一種PCR擴增引物對及其應用，尤其適用于對耐熱芽孢桿菌的檢測。

背景技術

耐熱芽孢桿菌Bacillussporothermodurans(BSTD)是一類具有較高耐熱性能的可以產內生孢子的細菌。19世紀80現代，在德國的超高溫殺菌處理(UltraHeatTreated，UHT)的牛奶中發現BSTD，隨后在歐洲的其他國家該菌也相繼被發現。Bertil在1996年對BSTD進行研究并命名，該菌種是細菌界，厚壁菌門，桿菌綱，芽孢桿菌目，芽孢桿菌科，芽孢桿菌屬，BSTD種；該菌種的模型菌種編號為M215(DSMZ10599)。

BSTD可能在一些食品或環境中存活并繁殖，由于該菌不會明顯改變食品的品質和口感，也不具有致病性，很容易在微生物檢測時被忽視，而且有研究表明食品中所檢測到的芽孢桿菌可能經歷土壤、飼料、消化、糞便和泌乳等環節，說明BSTD生存及繁殖能力比較強，不排除會給食品安全帶來潛在的風險。尤其在乳制品中，由于牛乳是細菌繁殖的最佳培養基，芽孢桿菌及其芽孢在原料乳中出現的概率很高；Hammer等人的研究表明，牛奶經過在30℃下培養5d，其所含的BSTD可達到10⁵CFU/mL。雖然BSTD不會導致乳制品變質，也不具有致病性，但會直接影響到乳制品的品質，同時也能夠反映出產品的生產過程存在瑕疵，還存在未知的風險；而且，國家對牛乳中微生物的新國標要求不高于200萬個/毫升，這就需要對BSTD有全面而深入的認識，從而使乳制品企業建立更加完善的微生物控制體系。

以上，由于食品企業尤其是乳品企業需要對BSTD進行實時監控，實現工業生產上對該芽孢桿菌的有效防控，所以一種有效檢測耐熱芽孢桿菌的方法是必要的。

發明內容

為了解決上述問題，本發明目的之一在于提供了一種PCR擴增引物對，該PCR擴增引物對對耐熱芽孢桿菌有很強的特異性，使用該PCR擴增引物對可以通過PCR擴增檢測方法對耐熱芽孢桿菌進行定性和定量分析。

為了達到上述目的，可以采用以下技術方案：

本發明一方面提供了一種PCR擴增引物對，其上游引物可以包含如SEQIDNO：1所示序列，下游引物可以包含如SEQIDNO：2所示序列。

本發明另一方面提供了一種檢測試劑，可以包括上述的PCR擴增引物對。

本發明再一方面提供了一種檢測試劑盒，可以包括上述的PCR擴增引物對或上述的檢測試劑。

本發明再一方面提供了一種上述的PCR擴增引物對或上述的檢測試劑或上述的檢測試劑盒在檢測耐熱芽孢桿菌中的應用。

本發明再一方面提供了一種耐熱芽孢桿菌的PCR擴增檢測方法，包括：將待檢測DNA模板使用上述的PCR擴增引物對進行PCR擴增得PCR擴增產物，對PCR擴增產物進行分析，從而判斷待檢測DNA模板中是否含有耐熱芽孢桿菌。

本發明再一方面提供了一種耐熱芽孢桿菌的PCR擴增檢測方法，可以包括：待檢測DNA模板與上述的檢測試劑混合后進行PCR擴增，在PCR擴增過程中，根據熒光信號判斷待檢測DNA模板中是否含有耐熱芽孢桿菌；根據CT值和標準曲線判斷待檢測DNA模板中耐熱芽孢桿菌的含量。

本發明有益效果至少包括：