[發明專利]一種番茄根尖原生質體單細胞懸液的制備方法及應用

有效

• 申請號: 202210700797.0
• 申請日: 2022-06-20
• 公開（公告）號: CN114940966B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發明（設計）人: 胡楠;李正國;張盟;唐夢雨;楊蒙蒙;馬縱橫;李艷華;蔡宇博;張坤朋;李鵬濤;盧全偉;劉乾坤;王濤;韋洋洋;彭仁海
• 申請（專利權）人: 安陽工學院;重慶大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 安陽金泰專利代理事務所(普通合伙) 41150
• 代理人: 王立武

1.一種番茄根尖原生質體單細胞懸液的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1、番茄種子滅菌后，加入適量無菌水，在搖床中進行孵育，使種子萌發；誘導番茄種子萌發的具體步驟為：取成熟飽滿的番茄種子，24-28℃搖床20h，待番茄種子露白后，選擇生長狀況良好的種子轉移至液體1/2?MS培養基中，黑暗條件下24-28℃靜置培養24-48h；

S2、使用超純水配制制備單細胞懸液所用的溶液，包括甘露醇溶液、酶解液以及洗滌液，其中酶解液和洗滌液冰浴；

S3、挑選出根部生長良好的番茄幼苗，放入步驟S2中制備好的甘露醇溶液中浸泡；

S4、從S3中選取合適長度根尖區域，用刀片切成根段，轉移至S2中的冰浴酶解液中；

S5、將S4中含有根段的酶解液在冰浴狀態下抽真空；

S6、將步驟S5制得的酶解液與根段的混合物放入搖床避光孵育酶解；

S7、將步驟S6制得的酶解產物用1mL的寬口槍頭轉移，通過細胞篩過濾，過濾完成后，向濾網加入適量洗滌液洗滌殘渣，經離心處理，去掉上清液，用寬口槍頭加入1mL洗滌液重懸原生質體并離心，連續處理3次，去掉上清液，制得細胞懸液；

S8、將步驟S7制得的細胞懸液稀釋，在顯微鏡下使用細胞計數板和臺盼藍染色檢測細胞濃度、活性，即可；

所述步驟S2中所述的甘露醇溶液的濃度為0.08g/mL的甘露醇水溶液；步驟S2所述的酶解液由如下組分組成：0.08g/mL甘露醇、20mM?KCL、20mM?MES、20mM?CaCl₂、20mM?MgCl₂、0.001g/mL的牛血清蛋白BSA、0.015g/mL的產自綠色木酶的纖維素酶R-10、0.005g/mL的產自根霉菌的離析酶R-10、0.001g/mL的產自日本曲霉的果膠酶Y-23、2.5-5.7U/mL的產自棘孢曲霉的果膠酶P2611，且酶解液需通過0.45um無菌濾膜過濾除菌；

所述步驟S2所述的洗滌液由如下成分組成：20mM?KCl、0.001g/mLBSA、0.08g/mL甘露醇、20mM?MES、10μM褪黑素，且洗滌液需通過0.45um無菌濾膜過濾除菌。

2.?根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S4中根尖長度為1-2?cm，切后根段長度為0.5-1mm。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S5所述的真空度為-0.05MPa，抽真空時間為10-30min。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S6所述搖床溫度為23-28℃，轉速設置為30-60r/min，孵育時間為2-3h。

5.?根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S7所述的細胞篩孔徑大小為40μm，所述的離心處理過程為于4℃，250-400?g轉速下離心3-6min。

6.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟S8所述的臺盼藍溶液濃度為0.4%，染色時臺盼藍溶液與細胞懸液比值為1:9-1:5，染色時間為1-3min。

7.一種根據權利要求1所述制備方法在構建番茄根尖單細胞轉錄組文庫中的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于，將利用權利要求1制備的單細胞懸液置于冰上，于30min內完成建庫。