[發明專利]一種番茄根尖原生質體單細胞懸液的制備方法及應用

有效

• 申請號: 202210700797.0
• 申請日: 2022-06-20
• 公開（公告）號: CN114940966B
• 公開（公告）日: 2023-09-29
• 發明（設計）人: 胡楠;李正國;張盟;唐夢雨;楊蒙蒙;馬縱橫;李艷華;蔡宇博;張坤朋;李鵬濤;盧全偉;劉乾坤;王濤;韋洋洋;彭仁海
• 申請（專利權）人: 安陽工學院;重慶大學
• 主分類號: C12N5/04
• 分類號: C12N5/04;C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 安陽金泰專利代理事務所(普通合伙) 41150
• 代理人: 王立武

本發明公開了一種番茄根尖原生質體單細胞懸液的制備方法及應用。本發明提供的制備方法，通過將番茄根尖原生質體通過處理、孵育、酶解、過濾、離心、活性檢測等過程，最終制成單細胞懸液。采用本發明所述方法制成的植物原生質體單細胞懸液，細胞活性高達90％以上，可滿足各類高通量單細胞測序平臺的細胞懸液質量要求，應用價值高。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種番茄根尖原生質體單細胞懸液的制備方法及其在構建單細胞轉錄組文庫中的應用。

背景技術

多細胞生物個體由多種形態功能各不相同的細胞組成，細胞的異質性在多細胞生物體中是普遍存在的生物學現象，不同細胞類群的功能及發育的分子調控機制亟待我們展開深入研究。近十年來，單細胞測序技術發展迅猛，目前具備高通量、低價格和單分子分辨率和高穩定性的10×genomics單細胞技術已經出現，這使萬級別的單細胞研究成本不斷降低。目前，單細胞測序技術已在腫瘤、免疫、發育等方向獲得了良好的應用，由于植物細胞中細胞壁的存在，目前單細胞測序技術在植物領域的研究進展緩慢，迄今為止在番茄中仍未見相關研究報道，截至目前單細胞測序在植物領域的報道還十分有限。植物細胞壁的主要成分是纖維素和果膠，只有有效去除細胞壁中的纖維素和果膠，我們才可能獲得高質量的植物單細胞懸液，從而突破植物單細胞測序技術障礙。

根尖是植物生命活動最為活躍的部分，對于營養物質和水分的吸收以及根的生長和伸長起到重要作用，在生理上具有非常重要的意義。目前還沒有番茄根單細胞分離并用于單細胞測序應用的相關報道，原因在于目前番茄根單細胞分離體系還不能在保證較好裂解效果的同時兼顧成活率，而且植物細胞壁一旦被去除導致植物細胞穩定性減弱，容易破碎，尤其是當植物細胞通過10×Genomics平臺進行分選時，這常常導致細胞捕獲率低。因此急需建立一種能兼顧高裂解效率，高細胞成活率和高細胞捕獲率的番茄根尖原生質體單細胞制備的方法，這對于單細胞測序技術在番茄中的發展有著重要作用，能夠為番茄其他器官組織的單細胞分離提供參考，推動單細胞測序技術在番茄中的應用。

發明內容

針對現有技術的空缺，本發明創造性的提供了一種番茄根尖原生質體單細胞懸液的制備方法，采用本發明所述方法制備原生質體單細胞懸液，細胞活性高達95％以上，且組織裂解完全，得到的細胞懸液濃度高，細胞總數多，可用于單細胞轉錄組測序文庫的構建，應用價值高。

為了達到上述目的，本發明采用的技術方案為：

一種番茄根尖原生質體單細胞懸液的制備方法，包括如下步驟：

?S1、將番茄種子滅菌后，24-28℃搖床20h，待番茄種子露白后，選擇生長狀況良好的種子轉移至液體1/2?MS培養基中，黑暗條件下24-28℃靜置培養24?h-48h；

S2、使用超純水配制原生質體分離用的溶液，所述溶液包括甘露醇溶液、酶解液、洗滌液；

S3、選取根部發育良好的番茄幼苗浸泡在甘露醇溶液中，靜置10?min；

S4、選取合適長度根尖區域，用鋒利刀片切成0.5-1mm的根段，放入冰浴酶解液中；

S5、將含有根段的酶解液在冰浴狀態下抽真空；

S6、將步驟S5制得的酶解液與根段的混合物放入搖床于23℃-28避光孵育2-3h，鏡檢至消化完全；

S7、將步驟S6制得的酶解產物用1mL的寬口槍頭轉移，通過細胞篩過濾，過濾完成后，向濾網加入2-4mL洗滌液洗滌殘渣，經離心處理，去掉上清液，用寬口槍頭加入1mL洗滌液重懸原生質體并離心，連續通過離心-洗滌處理2-3次，去掉上清液，制得細胞懸液；制備完成后用顯微鏡細胞計數板和臺盼藍染色檢測細胞濃度、活性，即可。

優選地，步驟S2中所述的甘露醇溶液由如下組分組成：8%（w/v）的甘露醇。