[發明專利]一種基于反轉錄轉座子鑒定沙子空心李種質的IRAP分子標記引物及其鑒定方法

在審

• 申請號: 202210693762.9
• 申請日: 2022-06-18
• 公開（公告）號: CN114854900A
• 公開（公告）日: 2022-08-05
• 發明（設計）人: 喬光;王貴;李蕊蕊;麥鵬坤
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 貴陽中新專利商標事務所 52100
• 代理人: 李亮;李龍

本發明公開了一種基于反轉錄轉座子鑒定沙子空心李種質的IRAP分子標記引物，其特征在于：所述的IRAP分子標記引物為Ty1?6、Ty1?7、Ty1?9、Ty1?15、Ty1?18、Ty1?20、Ty1?25、Ty3?2、Ty3?3、Ty3?5、Ty3?6、Ty3?9、Ty3?14及Ty3?16中的一種或一種以上混合。本發明從分子水平基于反轉錄轉座子的特性進行檢測，結果更為準確可靠；通過對數十種沙子空心李種質進行檢測，經多次重復，檢測結果均保持一致，結果準確可靠。

技術領域

本發明屬于分子生物學領域，涉及利用李反轉錄轉座子的RT序列開發IRAP引物、PCR擴增體系確立及其應用。

背景技術

沙子空心李(Prunus salicina Lindl.cv'Shazikongxinli'), 薔薇科李屬植物，是貴州省沿河縣孕育的地方特色李品種，2006年被評為國家地理標志保護產品，其栽培歷史悠久，口感獨特。沙子空心李一直是貴州沿河縣的重點項目及經濟支柱產業之一，截至2021年末為止，沙子空心李的種植面積達4.5萬畝，年產量2萬余噸，經濟效益達3.2億元。

目前，沙子空心李在長期的人工干預和自然變異下，劣質基因微突變積累，造成一些原始優良種性逐漸減弱；另外，沿河縣大力推廣沙子空心李種植面積時，不注重果園的科學管理，重栽輕管或栽而不管，同時種苗繁育存在不規范、來源眾多等問題，導致當前沙子空心李生產出現果實成熟期不一，果實品質參差不齊等現象，損壞了沙子空心李的品牌聲譽。目前沙子空心李在種質資源鑒定及指紋圖譜構建等方面存在空白，沒有明確的鑒定技術，因而有必要開發一種高效準確的分子鑒定技術，為沙子空心李優異種質的鑒別、保存及新種質挖掘提供服務。

IRAP(逆轉座子位點擴增多態性)是一種基于植物反轉錄轉座子序列間多態性的分子標記，目前已廣泛應用于種質資源鑒定、親緣關系鑒別及遺傳多樣性分析等方面，具有高通量、基因組覆蓋范圍廣、多態性豐富及異質性高等優點。

發明內容

本發明要解決的技術問題是：提供一種異質性鑒定水平高、分辨率好、穩定可靠、高效快捷基于基因水平上的鑒定方法。本方法可直接應用于沙子空心李種質資源鑒別、指紋圖譜構建、親緣關系鑒定及遺傳多樣性分析，為優異種質的保存、輔助育種及種質產權保護提供有效的手段。本發明需要解決的關鍵技術是高效IRAP引物的獲得及 PCR擴增體系的確立。

本發明的技術方案是：一種基于反轉錄轉座子鑒定沙子空心李種質的IRAP分子標記引物及其鑒定方法，其特征在于：所述的IRAP分子標記引物為Ty1-6、Ty1-7、Ty1-9、Ty1-15、Ty1-18、Ty1-20、Ty1-25、 Ty3-2、Ty3-3、Ty3-5、Ty3-6、Ty3-9、Ty3-14及Ty3-16中的一種或一種以上混合。

所述的IRAP分子標記，包括以下幾個步驟：

S1，提取供試沙子空心李幼嫩葉片基因組DNA；

S2，基于李反轉錄轉座子Ty1-copia和Ty3-gypsy的RT序列設計 IRAP引物；

S3，取S1的DNA，經PCR反應擴增過后通過1.5％瓊脂糖凝膠電泳，對設計的引物進行初步篩選，保留具備多態性，條帶清晰的IRAP 引物；

S4，利用初步篩選獲得的IRAP引物對所有供試材料進行IRAP分子標記分析，每個引物重復2-3次，根據擴增條帶的有無、多少及大小判定結果。

S3中PCR反應最優體系為：30ng/μl模板DNA 1.0μl，引物 1.3μl，PCR Mix 5.0μl及2.7μlddH₂O。

S3中所述的PCR反應程序為：94℃預變性4min，94℃變性30s， 51℃-58℃退火30s，72℃延伸1min，共40次循環，72℃再反應10min， 4℃保存。