[發明專利]一種巴戟天毛狀根遺傳轉化體系的建立方法

有效

• 申請號: 202210677260.7
• 申請日: 2022-06-16
• 公開（公告）號: CN114752621B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 徐世強;王繼華;楊少海
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 廣州鼎賢知識產權代理有限公司 44502
• 代理人: 覃現凱

一種巴戟天毛狀根遺傳轉化體系的建立方法，以巴戟天無菌組培苗的幼嫩莖段作為外植體，經預培養后轉移到侵染液中，侵染結束后將外植體表面的菌液吸干，然后進行共培養，將在共培養過程中形成菌斑的外植體用含有頭孢噻肟鈉和特美汀的無菌水清洗，清洗完的外植體轉接到含有頭孢噻肟鈉、特美汀和乙酰丁香酮的1/2 MS固體培養基上誘導毛狀根；當毛狀根長到2～3cm左右時，將毛狀根剪下并轉移到含有篩選抗生素的1/2 MS固體培養基上，篩選出具有卡那霉素抗性且生長速度快、分支較多的毛狀根發根系。本發明具有較高轉化效率，為后續的基因功能研究及利用基因工程手段提高巴戟天藥效活性成分的含量提供良好的技術支撐。

技術領域

本發明屬于植物基因工程領域，具體涉及一種巴戟天毛狀根遺傳轉化體系的建立方法。

背景技術

巴戟天（Morinda officinalis How）為茜草科巴戟天屬多年生藤本植物，以根入藥，具有補腎陽、抗骨質疏松、抗抑郁、抗炎鎮痛和祛風除濕的作用。臨床上，常用巴戟天配伍其他藥物治療腎虛、骨質疏松癥和風濕痹痛，例如金剛丸、巴戟丸、二仙湯、仙藤湯和三藤湯等。

發根農桿菌（Agrobacterium rhizogenes）是根瘤菌科農桿屬的一種革蘭氏陰性土壤細菌，能夠侵染大多數雙子葉植物、少數單子葉植物以及個別裸子植物。發根農桿菌中起關鍵作用的是其攜帶的Ri質粒，含有負責發根自主性生長和冠癭堿合成的基因。Ri質粒在結構上與Ti質粒類似，主要有致毒區（Vir），T-DNA區以及冠癭堿合成功能區等。根據合成冠癭堿的不同，Ri質粒分為4種類型：1）甘露堿型；2）黃瓜堿型；3）農桿堿型；4）米奇矛型。發根農桿菌菌株ATCC15834來源于American type culture collection (ATCC)，為發根農桿菌原始菌株。ATCC15834菌株含pRi15834農桿堿型Ri質粒，Ri質粒上含有誘導發根的rolC基因，侵染植物后導致大量毛根形成。發根農桿菌ATCC15834具有廣泛的宿主范圍（禾本科，豆科，煙草等），在植物遺傳轉化中有著廣闊的應用前景，特別適合對紫杉醇，青蒿等藥用植物毛狀根的誘導。

pBI121質粒是一個高效的植物雙元表達載體，來源于pB221和Bin19載體。pBI121載體含有從ColE1來源的ori復制元件，從CaMV中來源的pROK1元件，新霉素磷酸轉移酶II基因（Neomycin phosphotransferase II Gene, NptII），新霉素抗性基因（Neomycinresistant gene, NeoR）等元件。該載體攜帶卡那霉素抗性基因Kan篩選標記，在培育轉基因植物的研究中，卡那霉素抗性基因（kan）常作為篩選的標記基因，即只有含卡那霉素抗性基因的轉化轉植株才能在卡那霉素培養基上生長。

毛狀根又稱發狀根，是發根農桿菌侵染植物后誘導細胞產生的一種病理狀態，具有多分枝和失去向地性等特點，同時還具有激素自主性、生長周期短、穩定遺傳和次生代謝物質積累能力強等優點。因此，毛狀根遺傳轉化體系是研究基因功能以及利用合成生物學構建高效定向生物合成藥效單體的重要技術手段，尤其適用于以根入藥的中藥材。毛狀根遺傳轉化技術在人參、丹參、三七等藥用植物中的研究已經非常成熟，被廣泛應用于功能基因組學和天然藥物成分的開發利用的研究中。然而，目前僅有鄭傳進等報道以幼芽為外植體對南藥巴戟天毛狀根誘導的條件進行了研究，關于巴戟天的毛狀根遺傳轉化體系的研究目前尚未見報道，嚴重制約了巴戟天功能基因組學的研究及其應用。

發明內容

本發明針對現有技術的不足，提供一種巴戟天毛狀根遺傳轉化體系的建立方法，優化出具有較高轉化效率的發根農桿菌、外植體及處理方法等，為后續的基因功能研究及利用基因工程手段提高巴戟天藥效活性成分的含量提供較好的技術支撐。

為了實現上述目的，本發明采用了以下技術方案：

一種巴戟天毛狀根遺傳轉化體系的建立方法，包括如下步驟：

（1）外植體的預培養