[發明專利]一種巴戟天毛狀根遺傳轉化體系的建立方法

有效

• 申請號: 202210677260.7
• 申請日: 2022-06-16
• 公開（公告）號: CN114752621B
• 公開（公告）日: 2022-09-30
• 發明（設計）人: 徐世強;王繼華;楊少海
• 申請（專利權）人: 廣東省農業科學院作物研究所
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82
• 代理公司: 廣州鼎賢知識產權代理有限公司 44502
• 代理人: 覃現凱

1.一種巴戟天毛狀根遺傳轉化體系的建立方法，其特征在于，包括如下步驟：

（1）外植體的預培養：

以巴戟天無菌組培苗的幼嫩莖段作為外植體，置于含有80～120 μM乙酰丁香酮的MS固體培養基中，22～28℃暗培養2～3 d；

（2）侵染液配制：

將含有目的基因的植物表達載體轉化至發根農桿菌，并且制備成侵染液；

所述的侵染液配制方法如下：

a. 通過凍融法將含目的基因的植物表達載體轉化至發根農桿菌ATCC15834；所述的含有目的基因的植物表達載體為pBI121-bHLH25；

b. 在無菌操作臺中，用接種環挑取上述轉化后的發根農桿菌ATCC15834，劃線到含40～60 mg/L 卡那霉素的YEP 固體培養基，于25～30 ℃倒置培養48～72 h；

c. 挑取單個菌落，接種到1.5 mL含40～60 mg/L 卡那霉素的YEB液體培養基中，200～250 r/min、25～30℃過夜培養16～18 h；

d. 按照0.5%～1%的接種量，接入到 50 mL含40～60 mg/L 卡那霉素的 YEB 的液體培養基中，25～30 ℃，200～250 r/min振蕩培養；

e. 當菌液濃度達到OD₆₀₀為 0.6～0.8時，離心后倒掉上清液收集菌體；

f. 加入等體積新鮮的MS液體培養基重懸農桿菌，離心后倒掉上清液收集菌體；

g. 加入等體積新鮮的MS液體培養基重懸農桿菌，并加入80～120 μM 乙酰丁香酮，常溫放置1～2 h，即為侵染液；

（3）發根農桿菌的侵染：

將預培養后的莖段轉移到步驟（2）得到的侵染液中，25～30℃、50～100 r/min震蕩10～30 min，使預培養的外植體與發根農桿菌之間充分接觸；

（4）共培養：

侵染結束后，用無菌濾紙將外植體表面的菌液吸干，然后轉接到含有80～120 μM 乙酰丁香酮的MS 固體培養基中，22～28 ℃暗培養條件下共培養2～3 d；

（5）洗菌：

將在共培養過程中形成菌斑的外植體用含有250～350 mg/L頭孢噻肟鈉和150～250mg/L特美汀的無菌水清洗2～3 次，然后用無菌濾紙吸干外植體表面的水分；

（6）毛狀根的誘導：

將清洗完的外植體轉接到含有250～350 mg/L 頭孢噻肟鈉、150～250 mg/L 特美汀和80～120 μM 乙酰丁香酮的1/2 MS 固體培養基上，置于28℃的恒溫培養箱中；每隔一周繼代培養一次，逐漸降低除菌抗生素的濃度，直至外植體周圍的菌斑完全消失；所述繼代培養的條件如下：培養溫度為25～30 ℃，光照條件為每天14 h光照、10 h黑暗；

（7）陽性毛狀根的篩選：

當誘導出來的毛狀根長到 2～3 cm左右時，將毛狀根剪下并轉移到含有濃度為28～32mg/L卡那霉素的1/2 MS 固體培養基上，25～30 ℃暗培養，篩選出具有卡那霉素抗性且生長速度快、分支較多的毛狀根發根系。

2.如權利要求1所述的巴戟天毛狀根遺傳轉化體系的建立方法，其特征在于，步驟（1）所述外植體來自巴戟天的無菌組培苗，幼嫩莖段為組培苗植株上部2～3片葉以上的莖段，沿幼嫩莖段斜下30度角輕輕劃傷莖段表層，不要劃斷莖段。

3.如權利要求1所述的巴戟天毛狀根遺傳轉化體系的建立方法，其特征在于，步驟（1）所述巴戟天無菌組培苗的培養方法如下：

挑選生長健壯的巴戟天植株枝條，去掉葉片，先用70％的酒精消毒20～30 s，接著置于3%的次氯酸鈉溶液中浸泡20～30 min，最后用無菌水沖洗5～6次；根據腋芽位置切成1 cm左右的莖段，扦插到含0.5 mg/L 6-BA的MS固體培養基中，置于28℃光照培養箱中培養，16h光照/8 h黑暗，當腋芽長至4～5 cm時，即可用于切取外植體侵染。