[發(fā)明專利]一步法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法及其菌株構(gòu)建

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210677092.1
• 申請日: 2022-06-16
• 公開（公告）號: CN114752544B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱凌峰;陳俞妃;趙長樂;羅小舟
• 申請（專利權(quán)）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司;中國科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/60;C12N15/77;C12P13/00;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發(fā)明公開了一步法生產(chǎn)γ?氨基丁酸的方法及其菌株構(gòu)建，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明構(gòu)建了一種可用于γ?氨基丁酸生產(chǎn)的谷氨酸棒桿菌底盤細(xì)胞，并通過表達(dá)谷氨酸脫羧酶GAD酶突變體，提高了重組谷氨酸棒桿菌在pH 7.0條件下從葡萄糖一步法發(fā)酵生產(chǎn)GABA的產(chǎn)量，使GABA產(chǎn)量達(dá)到114 g/L，是目前報(bào)道最高值，且極大降低了成本，使GABA生產(chǎn)成本可小于谷氨酸生產(chǎn)成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一步法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的方法及其菌株構(gòu)建，屬于基因工程和酶工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

γ-氨基丁酸(GABA)是一種四碳的非蛋白氨基酸，它在自然界中廣泛存在，從微生物到植物和動物，具有預(yù)防及治療失眠、降壓、抗焦慮、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、利尿等功能，可用于治療各種神經(jīng)功能障礙。GABA作為合成2-吡咯烷酮和可生物降解材料-聚酰胺尼龍4的前體也受到了廣泛的關(guān)注，進(jìn)一步將其應(yīng)用領(lǐng)域擴(kuò)展到工業(yè)領(lǐng)域。

GABA的合成有很多方式，包括化學(xué)合成，酶促或全細(xì)胞生物催化和微生物發(fā)酵。與化學(xué)合成相比，GABA的生物合成具有許多優(yōu)勢，如簡單的后處理程序，更溫和的反應(yīng)條件，較高的產(chǎn)品收率，更高的產(chǎn)物選擇性以及更低的環(huán)境污染性等。GABA生物合成的主要途徑是經(jīng)L-谷氨酸由谷氨酸脫羧酶GAD催化的不可逆的脫羧反應(yīng)。谷氨酸脫羧酶（GAD）能夠以磷酸吡多醛（PLP）作為輔因子催化將谷氨酸（Glu）生成GABA，是GABA生產(chǎn)的關(guān)鍵性酶。已經(jīng)有一些國內(nèi)外的文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于用谷氨酸棒桿菌生產(chǎn)GABA，在2011年，研究人員首次報(bào)道了在谷氨酸棒桿菌中表達(dá)來自短乳桿菌Lb85的谷氨酸脫羧酶能夠產(chǎn)低濃度但可檢測的GABA。另有報(bào)道利用外源表達(dá)大腸桿菌W3110的GadB，重組谷氨酸棒桿菌經(jīng)過優(yōu)化的發(fā)酵過程可產(chǎn)生12.37 g/L的GABA。Zhang等人基于重組谷氨酸棒桿菌，從葡萄糖開發(fā)有效的直接生物合成途徑，無需添加昂貴的PLP輔因子，通過兩階段pH控制策略發(fā)酵70小時(shí)，GABA產(chǎn)量達(dá)到70.6 g/L。

谷氨酸脫羧酶催化谷氨酸生成GABA，該反應(yīng)消耗質(zhì)子，從而可以增加環(huán)境的pH值。許多谷氨酸脫羧酶在pH4至5范圍內(nèi)均表現(xiàn)出最佳活性，并且其活性在pH值高于6時(shí)急劇下降，在pH 7時(shí)幾乎失活。有些研究報(bào)道了一些突變體，提高其在中性pH下活力，但目前研究中，谷氨酸脫羧酶突變體的最適pH都沒有改變，大部分沒能提高pH高于6時(shí)的酶活，在pH7.0條件下仍幾乎失活。

目前市場上GABA的生產(chǎn)都是利用谷氨酸作為前體，通過全細(xì)胞或者酶催化來實(shí)現(xiàn)，而從葡萄糖直接發(fā)酵產(chǎn)GABA更具成本優(yōu)勢。生物合成谷氨酸需要在pH 7.0的中性條件下，但GAD最適pH為4至5，在pH 7.0條件下幾乎失活。所以即使GABA直接發(fā)酵的研究，也一般運(yùn)用兩步法發(fā)酵：第一步，中性pH（pH 7左右）條件下產(chǎn)谷氨酸；第二步，酸性pH（pH 5左右）產(chǎn)GABA。與一步法直接發(fā)酵生產(chǎn)GABA相比，兩步法會導(dǎo)致發(fā)酵時(shí)間過長，產(chǎn)量較低，成本增加。在常用工業(yè)底盤菌株內(nèi)，與大腸桿菌等相比，谷氨酸棒桿菌（Corynebacterium glutamicum）是安全的生產(chǎn)菌株（General Regarded As Safe, GRAS），其生產(chǎn)的GABA可應(yīng)用于食品。谷氨酸棒桿菌還是出色的谷氨酸生產(chǎn)菌，而谷氨酸是GABA的直接前體，所以谷氨酸棒桿菌是大規(guī)模生產(chǎn)GABA的潛力菌株。總之目前市場中以谷氨酸為底物的全細(xì)胞及酶催化，或者兩步法發(fā)酵，相比較一步法直接發(fā)酵，成本都會更高。

發(fā)明內(nèi)容

為解決現(xiàn)有的谷氨酸脫羧酶pH不適用于GABA一步法生產(chǎn)，及全細(xì)胞催化，酶催化和兩步法生產(chǎn)GABA存在的諸如成本高、產(chǎn)量低、工藝復(fù)雜等缺陷，本發(fā)明提供了一種在pH7.0條件下具有較高活性的GAD酶突變體及能夠利用葡萄糖一步法生產(chǎn)γ-氨基丁酸的谷氨酸棒桿菌。

本發(fā)明提供了可用于一步法生產(chǎn)GABA的重組谷氨酸棒桿菌，表達(dá)谷氨酸脫羧酶，并進(jìn)行了如下至少一種改進(jìn)：

（1）敲除絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknG；所述絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PknG的Genbank登錄號為BAC00145.1；