[發明專利]一步法生產γ-氨基丁酸的方法及其菌株構建

有效

• 申請號: 202210677092.1
• 申請日: 2022-06-16
• 公開（公告）號: CN114752544B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發明（設計）人: 朱凌峰;陳俞妃;趙長樂;羅小舟
• 申請（專利權）人: 森瑞斯生物科技（深圳）有限公司;中國科學院深圳先進技術研究院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/60;C12N15/77;C12P13/00;C12R1/15
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

1.一種重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，表達氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示的谷氨酸脫羧酶，并進行了（1）~（9）的改進：

（1）敲除或缺失絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因pknG；所述絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶基因pknG編碼的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAC00145.1所示；

（2）敲除或缺失氨基轉移酶基因bioA，并過表達磷酸烯醇丙酮酸羧化酶和谷氨酸脫氫酶；所述氨基轉移酶基因bioA編碼的氨基酸序列如Genbank：BAB99997.1所示；所述磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAB98892.1所示；所述谷氨酸脫氫酶的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAB99472.1所示；

（3）敲除或缺失轉運蛋白基因gabP，并過表達丙酮酸羧化酶；所述轉運蛋白基因gabP編碼的氨基酸序列如Genbank：BAB97874.1所示；所述丙酮酸羧化酶的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAB98082.1所示；

（4）敲除或缺失磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因pck，并過表達吡哆醛激酶；所述磷酸烯醇丙酮酸羧化激酶基因pck編碼的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAC00257.1所示；所述吡哆醛激酶的氨基酸序列如Genbank登錄號：WP_003641112.1所示；

（5）用啟動子P_gltA增強檸檬酸合酶基因gltA的表達；所述啟動子P_gltA的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述檸檬酸合酶基因gltA編碼的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAB98222.1所示；

（6）敲除或缺失草酰乙酸脫羧酶基因odx；所述草酰乙酸脫羧酶基因odx編碼的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAB98683.1所示；

（7）用弱RBS表達酮戊二酸脫氫酶基因odhA；所述弱RBS的序列為CTCACCCACGAGTTCAATAACTAGG；所述酮戊二酸脫氫酶基因odhA編碼的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAB98522.1所示；

（8）敲除或缺失乳酸脫氫酶基因ldh，并過表達異檸檬酸脫氫酶；所述乳酸脫氫酶基因ldh編碼的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAC00305.1所示；所述異檸檬酸脫氫酶的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAB98057.1所示；

（9）敲除或缺失乳酸脫氫酶2基因lldD，用啟動子P_tuf增強谷氨酸脫氫酶基因gdh的表達；所述啟動子P_tuf增強的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；所述乳酸脫氫酶2基因lldD編碼的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAC00312.1所示；所述谷氨酸脫氫酶的氨基酸序列如Genbank登錄號：BAB99472.1所示。

2.根據權利要求1所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，以pCES、pJC1或pAN6質粒為表達載體表達所述谷氨酸脫羧酶。

3.根據權利要求1或2所述的重組谷氨酸棒桿菌，其特征在于，以谷氨酸棒桿菌ATCC13032或谷氨酸棒桿菌ATCC 13869為宿主細胞。