[發(fā)明專(zhuān)利]高表達(dá)FRα的重組載體、重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法和用途

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210673874.8
• 申請(qǐng)日: 2022-06-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115161345A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-10-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 卜婷婷;嚴(yán)柳柳;張楠
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 同宜醫(yī)藥（蘇州）有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N15/867
• 分類(lèi)號(hào): C12N15/867;C12N7/01;C12N15/12;C12N5/10;C12Q1/02;C12R1/91;C12R1/93
• 代理公司: 北京林達(dá)劉知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11277
• 代理人: 劉新宇;李茂家

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體而言，本發(fā)明涉及一種包含F(xiàn)Rα編碼基因的重組病毒載體、包含F(xiàn)Rα編碼基因的重組病毒顆粒、高表達(dá)FRα的重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法和用途。本發(fā)明通過(guò)選擇特定的表達(dá)FRα的基因序列，構(gòu)建含有FRα編碼基因的重組病毒載體及重組病毒顆粒，然后將其穩(wěn)轉(zhuǎn)到MDA?MB?231細(xì)胞株中，通過(guò)在轉(zhuǎn)染過(guò)程中降低培養(yǎng)基中的血清濃度，添加polybrene，以及調(diào)整MOI值提高病毒轉(zhuǎn)染效率，最終獲得高表達(dá)FRα的細(xì)胞模型，可用于以FRα為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物的篩選評(píng)價(jià)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種高表達(dá)FRα的重組載體、重組細(xì)胞及其構(gòu)建方法和用途。

背景技術(shù)

葉酸受體α(FRα)由FOLR1基因編碼，是分子量為38-40kDa的細(xì)胞表面糖蛋白，最初發(fā)現(xiàn)是作為葉酸結(jié)合蛋白，能在牛奶中和葉酸結(jié)合，1991年作為腫瘤相關(guān)抗原被克隆。FRα是高親和力FRs家族的一個(gè)成員，F(xiàn)Rs家族還包括FRβ、FRγ和FRδ，它們分別由FOLR2、FOLR3和FOLR4基因編碼。

FRα對(duì)還原葉酸(如5-甲基四氫葉酸和四氫葉酸)和葉酸有很高的親和力，這些葉酸與FRα的結(jié)合促進(jìn)了細(xì)胞膜上受體-配體復(fù)合物的聚集，然后經(jīng)過(guò)胞吞作用內(nèi)化、與溶酶體融合并酸化，最終釋放出葉酸，參與之后的碳轉(zhuǎn)移反應(yīng)。FRα現(xiàn)已被證實(shí)在正常細(xì)胞中表達(dá)受限，而在絕大多數(shù)的卵巢癌以及在很多子宮癌、子宮內(nèi)膜癌、胰腺癌、腎癌、肺癌和乳腺癌中過(guò)度表達(dá)，F(xiàn)Rα參與腫瘤的浸潤(rùn)、轉(zhuǎn)移、進(jìn)展，成為腫瘤治療有吸引力的靶點(diǎn)。因此，目前FRα相關(guān)的靶向藥物也在臨床中有著廣泛的應(yīng)用，在臨床診斷方面的應(yīng)用有靶向FRα的葉酸基共軛放射性核素造影劑以及葉酸-FITC偶聯(lián)探針進(jìn)行熒光成像等；在治療方面的應(yīng)用更是百花齊放，從目前在研的產(chǎn)品藥物類(lèi)型去看，F(xiàn)Rα在CAR-T、PROTAC、抗體、ADC、PDC藥物等方面均有著應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容

發(fā)明要解決的問(wèn)題

目前，F(xiàn)Rα缺乏體外高表達(dá)媒介。為此，本發(fā)明通過(guò)選擇特定的表達(dá)FRα的FOLR1基因，構(gòu)建含有FOLR1基因的報(bào)告系統(tǒng)載體，然后將其穩(wěn)轉(zhuǎn)到MDA-MB-231細(xì)胞株中，獲得高表達(dá)FRα的抗腫瘤藥物篩選細(xì)胞模型，可用于以FRα為靶點(diǎn)的抗腫瘤藥物的靶向藥效評(píng)價(jià)。

用于解決問(wèn)題的方案

[1]、一種包含葉酸受體α的編碼基因的重組病毒載體，其中，

所述葉酸受體α的編碼基因包含如下(i)或(ii)所示的核苷酸序列：

(i)如SEQ ID NO.1所示的序列；

(ii)與SEQ ID NO.1所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列；

所述病毒載體選自腺病毒載體、慢病毒載體或逆轉(zhuǎn)錄病毒載體；

優(yōu)選地，所述重組病毒載體為重組慢病毒載體，所述重組慢病毒載體包含如下(iii)或(iv)所示的核苷酸序列：

(iii)如SEQ ID NO.2所示的序列；

(iv)與SEQ ID NO.2所示的序列具有80％以上同源性的核苷酸序列。

[2]、一種包含葉酸受體α的編碼基因的重組病毒顆粒，其中，所述重組病毒顆粒由如[1]所述的重組病毒載體經(jīng)過(guò)病毒包裝后得到。

[3]、一種表達(dá)葉酸受體α的重組細(xì)胞，其中，所述重組細(xì)胞包含如[2]所述的重組病毒顆粒；優(yōu)選地，所述重組細(xì)胞來(lái)源于如下任一種細(xì)胞系：MDA-MB-231、HEC1B、PANC-1、TK10、A549。

[4]、一種表達(dá)葉酸受體α的重組細(xì)胞的構(gòu)建方法，其中，所述構(gòu)建方法包括如下步驟：

病毒感染步驟：將如[2]所述的重組病毒顆粒與癌細(xì)胞、細(xì)胞培養(yǎng)基和聚凝胺混合，進(jìn)行共孵育；