[發(fā)明專利]一種可高效表達(dá)飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210673650.7
• 申請(qǐng)日: 2022-06-14
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114921487A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 游錫火;王玉萬(wàn);薛棟升;夏勝;曾徐浩;蔣慧;胡燕;梁大明;田美華;姜本榮;齊義清;沈力
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中農(nóng)華威生物制藥（湖北）有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/81
• 分類號(hào): C12N15/81;C12N15/56;C12N15/61;C12N1/19;C12N9/30;C12R1/84
• 代理公司: 北京慕達(dá)星云知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 齊寶玲

本發(fā)明公開(kāi)了一種重組表達(dá)載體，包括pPIC9K?amy載體和pGAPZA?PDI載體，其中，pPIC9K?amy載體由α?淀粉酶目的基因amy和表達(dá)載體pPIC9K連接而成；pGAPZA?PDI載體由伴侶因子目的基因PDI和表達(dá)載體pGAPZA連接而成以所述引物構(gòu)建重組畢赤酵母菌株，將目的基因amy整合到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組菌株，然后將擴(kuò)增伴侶因子PDI的目的基因整合到重組菌株中，得到高效表達(dá)飼用低溫α?淀粉酶的畢赤酵母菌。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程和發(fā)酵技術(shù)領(lǐng)域，更具體地說(shuō)是涉及一種可高效表達(dá)飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

淀粉是單胃動(dòng)物能量的主要來(lái)源，其供能占總能量需求的60％～80％。幼齡動(dòng)物消化系統(tǒng)發(fā)育不成熟，淀粉酶分泌不足，限制了淀粉的消化吸收。隨著動(dòng)物日糧配方的富營(yíng)養(yǎng)化、飼養(yǎng)條件應(yīng)激和環(huán)境污染問(wèn)題越來(lái)越突出，成年健康動(dòng)物添加“外源性營(yíng)養(yǎng)消化酶”的作用也越來(lái)越明顯，意義也越來(lái)越大。通過(guò)添加外源性淀粉酶來(lái)提高飼料淀粉的消化吸收，對(duì)于提高動(dòng)物生產(chǎn)性能、節(jié)約飼料資源意義重大。

目前飼料專用淀粉酶的研究開(kāi)發(fā)較少，一般均采用食品加工、化纖，印染等工業(yè)用酶。中溫α-淀粉酶是飼料工業(yè)中應(yīng)用最多的淀粉酶，其最適作用溫度為70～80℃，pH值5.0以下失活嚴(yán)重。動(dòng)物生理環(huán)境溫度一般為37～42℃，胃內(nèi)pH值較低，中溫淀粉酶在動(dòng)物消化道內(nèi)發(fā)揮作用甚微。低溫淀粉酶最適作用溫度比中溫淀粉酶要低20～30℃，因此，研究開(kāi)發(fā)低溫淀粉酶對(duì)飼料用酶而言具有重要意義。

飼用淀粉酶應(yīng)具備以下幾個(gè)條件:在動(dòng)物體溫(37～42℃)的溫度條件下能發(fā)揮高的活性；最適pH值與消化道內(nèi)食糜的pH相一致；對(duì)淀粉有高的酶解效率(內(nèi)切酶)；具有良好的穩(wěn)定性(在飼料高溫制粒過(guò)程中的穩(wěn)定性、保存過(guò)程中的穩(wěn)定性以及在動(dòng)物消化道中對(duì)胃酸、胃蛋白酶、胰蛋白酶、金屬離子等的耐受性)。

α-淀粉酶最適溫度為35℃左右，與飼用淀粉酶標(biāo)準(zhǔn)相似，如果能通過(guò)發(fā)酵工程策略，將表達(dá)α-淀粉酶的基因轉(zhuǎn)化至菌種中，提高畢赤酵母外源蛋白表達(dá)量，則可以提高專用α-淀粉酶的產(chǎn)量。

因此，如何構(gòu)建一種重組表達(dá)載體、高效表達(dá)α-淀粉酶的畢赤酵母菌株是本領(lǐng)域技術(shù)人員亟需解決的問(wèn)題。

發(fā)明內(nèi)容

有鑒于此，本發(fā)明提供了一種重組表達(dá)載體、應(yīng)用、重組菌株和發(fā)酵方法。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

一種重組表達(dá)載體，包括pPIC9K-amy載體和pGAPZA-PDI載體，其中，pPIC9K-amy載體由α-淀粉酶目的基因amy和表達(dá)載體pPIC9K連接而成；pGAPZA-PDI載體由伴侶因子目的基因PDI和表達(dá)載體pGAPZA連接而成。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)上述重組表達(dá)載體在構(gòu)建高效表達(dá)飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母菌株中的應(yīng)用。

作為與上述技術(shù)方案相同的發(fā)明構(gòu)思，本發(fā)明還請(qǐng)求保護(hù)一種高效表達(dá)飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母的構(gòu)建方法，過(guò)程為：將目的基因amy整合到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建重組菌株，然后將擴(kuò)增伴侶因子PDI的目的基因整合到重組菌株中，得到高效表達(dá)飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母菌株。

作為上述技術(shù)方案優(yōu)選的技術(shù)方案，將目的基因amy整合到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中的過(guò)程為：以SEQ ID NO.6所示的基因序列為模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2為引物，擴(kuò)增低溫α-淀粉酶的目的基因amy，構(gòu)建表達(dá)載體pPIC9K-amy，將載體線性化后，整合到畢赤酵母感受態(tài)細(xì)胞中，構(gòu)建了重組菌株。