[發明專利]一種可高效表達飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母構建方法

在審

• 申請號: 202210673650.7
• 申請日: 2022-06-14
• 公開（公告）號: CN114921487A
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發明（設計）人: 游錫火;王玉萬;薛棟升;夏勝;曾徐浩;蔣慧;胡燕;梁大明;田美華;姜本榮;齊義清;沈力
• 申請（專利權）人: 中農華威生物制藥（湖北）有限公司
• 主分類號: C12N15/81
• 分類號: C12N15/81;C12N15/56;C12N15/61;C12N1/19;C12N9/30;C12R1/84
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 齊寶玲

1.一種重組表達載體，其特征在于，包括pPIC9K-amy載體和pGAPZA-PDI載體，其中，pPIC9K-amy載體由α-淀粉酶目的基因amy和表達載體pPIC9K連接而成；pGAPZA-PDI載體由伴侶因子目的基因PDI和表達載體pGAPZA連接而成。

2.權利要求1所述的重組表達載體在構建高效表達飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母菌株中的應用。

3.一種高效表達飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母的構建方法，其特征在于，過程為：將目的基因amy整合到畢赤酵母感受態細胞中，構建重組菌株，然后將擴增伴侶因子PDI的目的基因整合到重組菌株中，得到高效表達飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母菌株。

4.根據權利要求3所述的一種高效表達飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母的構建方法，其特征在于，將目的基因amy整合到畢赤酵母感受態細胞中的過程為：以SEQ ID NO.6所示的基因序列為模板，以SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2為引物，擴增低溫α-淀粉酶的目的基因amy，構建表達載體pPIC9K-amy，將載體線性化后，整合到畢赤酵母感受態細胞中，構建了重組菌株。

5.根據權利要求4所述的一種高效表達飼用低溫α-淀粉酶的畢赤酵母的構建方法，其特征在于，將擴增伴侶因子PDI的目的基因整合到重組菌株中的過程為：以SEQ ID NO.8所示的基因序列為模板，以SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所述序列為引物，擴增伴侶因子PDI的目的基因，構建表達載體pGAPZA-PDI，將載體線性化后，整合到重組菌株中。

6.一種畢赤酵母菌株，其特征在于，所述菌株由權利要求3-5任一所述的構建方法構建得到。

7.權利要求3-5任一所述的構建方法構建得到的畢赤酵母在產飼用低溫α-淀粉酶中的應用。

8.一種發酵產飼用低溫α-淀粉酶的方法，其特征在于，過程包括：將權利要求3-5任一得到的畢赤酵母菌株活化，制成種子液，接種到BMGY培養基中，30℃、250rpm培養20h，離心收集菌體，接種到BMGY誘導培養基中，于30℃、250rpm誘導培養120h取樣檢測相關指標，并每隔24h添加2％(V/V)甲醇，將發酵液離心后，去除菌體沉淀，發酵液即為低溫α-淀粉酶。

9.根據權利要求8所述的一種發酵產飼用低溫α-淀粉酶的方法，其特征在于，1L BMGY生長培養基包括：1％酵母粉、2％蛋白胨、1.34％YNB、1％(V/V)甘油，10％PBS pH 6.0緩沖溶液；

1L BMMY誘導培養基包括：1％酵母粉，2％蛋白胨，1.34％YNB，1％甲醇，10％PBS緩沖溶液。