[發明專利]恒溫環型核酸擴增法引物組及以其擴增核酸的方法

在審

• 申請號: 202210673420.0
• 申請日: 2022-06-14
• 公開（公告）號: CN115537455A
• 公開（公告）日: 2022-12-30
• 發明（設計）人: 施奉英
• 申請（專利權）人: 臺達電子國際（新加坡）私人有限公司
• 主分類號: C12Q1/6848
• 分類號: C12Q1/6848;C12N15/11
• 代理公司: 隆天知識產權代理有限公司 72003
• 代理人: 向勇

一種LAMP引物組，包括FIP、BIP、F3、與B3之原始LAMP引物，以及至少一自主引物。原始LAMP引物靶向核酸上的區域F3、F2、F1C、B1C、B2、及B3，且區域F3、F2、F1、B1C、B2C、及B3C在核酸之一順向鏈的5’端往3’端依序排列。引物FIP包括靶向區域F1C及F2的寡核苷酸，且引物BIP包括靶向區域B1C及B2的寡核苷酸。至少一自主引物靶向的一區域位在從F3到B3的區域之外。

【技術領域】

本案系關于一種恒溫環型核酸擴增法(loop-mediated isothermalamplification,LAMP)引物組，尤指一種具有額外自主引物的LAMP引物組。

【背景技術】

恒溫環型核酸擴增法(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)自2000年初由日本榮研化學公司(Eiken Chemical Co.Ltd)的Notomi等人公開以來，因其具有簡單、專一、靈敏、且快速等優點，而被廣泛用于快速診斷植物病原體或傳染病病原體的測定開發中，尤其是在即時現場設置(field settings)中。由于LAMP設計了靶向(targeting)待測核酸的六或八段獨特序列的四個或六個特異性引物，因此提高了其特異性。

圖1顯示LAMP設計的原始引物示意圖。四個為一組的LAMP原始引物包括F3、B3、FIP、及BIP。FIP(forward inner primer)及BIP(backward inner primer)稱為內部引物，每一個都由兩個引物頭尾相連或由一個TTTT連接子相連所組成。這四個引物靶向六個區域，即目標模板上的區域F3、F2、F1C、B1C、B2、及B3。區域F1C及B1C的解鏈溫度(meltingtemperatures，Tms)高于區域F2及B2，而區域F2及B2的解鏈溫度又高于區域F3及B3，以確保引物FIP及BIP比引物F3及B3的退火(annealing)速度更快且擴增更早。引物F3及B3為置換引物(displacement primer)，其擴增將置換引物FIP及BIP所產生的擴增子(amplicon)，并作為循環擴增步驟的模板。四個LAMP引物的擴增方向在圖1中以黑色箭頭表示。

與大多數基于聚合酶連鎖反應(polymerase chain reaction,PCR)的檢測分析相比，LAMP因使用更多引物數量及更高引物濃度的特殊設計與工作機制而可提供更高的靈敏度。由于具有特殊引物設計且利用具有鏈置換活性(strand-displacement activity)的聚合酶，使得LAMP可通過自我引發(self-priming)來進行等溫擴增。LAMP在恒溫下進行，通常為60-65℃，而這取決于所使用的聚合酶，因此可以無需使用熱循環儀。此外，陽性檢測通常可在30分鐘內完成，并且可以通過比色法或濁度進行目視檢測。綜合而言，LAMP是一種理想的核酸擴增及檢測技術，可滿足WHO對即時照護(point-of-care)/即時需求(point-of-need)檢測的要求。

雖然與大多數基于PCR的擴增方法相比，LAMP被認為具有更高的靈敏度，但低靈敏度仍可能是一個問題，因為反應溫度在60-65℃的范圍通常不足以使目標變性，尤其是那些具有高GC含量(GC-content,guanine-cytosine content)及/或強二級結構的目標。有時可通過挑選不同的LAMP引物組來解決某些引物性能不佳的問題，因此通常的做法是挑選幾組候選引物再從中篩選具有較佳檢測靈敏度的引物。此外，也可通過反應優化(reactionoptimization)來提高靈敏度，而反應中涉及的所有因素都可以是待優化的潛在因素，例如反應溫度，聚合酶類型，酶量，引物、dNTP、及鎂離子的濃度，以及反應促進添加劑的使用，例如二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)及甜菜堿(betaine)。