[發(fā)明專利]一種基于CcmK2纖維狀蛋白的亞精胺合成多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210672219.0
• 申請日: 2022-06-14
• 公開（公告）號: CN114958894B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王昕;胡鑫峰;陳可泉;劉逸;王靖;周彩蓮
• 申請（專利權(quán)）人: 南京工業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12N15/54;C12N15/60;C12P13/00
• 代理公司: 南京擎天知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32465
• 代理人: 藍(lán)霞

本發(fā)明公開了一種基于CcmK2纖維狀蛋白的亞精胺合成多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。利用來源于自然界中的纖維小體中存在的相互作用蛋白對，將亞精胺合酶SpeE和S?腺苷蛋氨酸脫羧酶SpeD分別融合粘連蛋白CohesinⅡ和錨定蛋白DockerinⅡ，利用CohesinⅡ和DockerinⅡ的相互作用，形成SpeE?SpeD雙酶結(jié)合體；再在CohesinⅡ上融合結(jié)合分子肽SpyTag，將SpeE?SpeD雙酶結(jié)合體組裝到融合結(jié)合蛋白SpyCatche的纖維狀蛋白CcmK2上；形成多酶復(fù)合體。本發(fā)明多酶復(fù)合體在多酶之間形成底物通道，拉近底物與酶之間的空間距離，提高了中間體的傳遞效率，充分發(fā)揮雙酶間的協(xié)同作用，大大提高了亞精胺的合成效率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種基于CcmK2纖維狀蛋白的亞精胺按合成多酶復(fù)合體的構(gòu)建方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

亞精胺是一種自然界中廣泛存在的多胺類物質(zhì)，幾乎存在于自然界的所有動(dòng)植物體內(nèi)。亞精胺在DNA的復(fù)制、翻譯和轉(zhuǎn)錄方面起著至關(guān)重要的作用，具有促進(jìn)心血管保護(hù)、參與蛋白質(zhì)與RNA的合成、抗氧化、抗炎、誘導(dǎo)細(xì)胞自噬、調(diào)節(jié)神經(jīng)、改善線粒體代謝、延緩衰老、提高記憶力等多種功能。在農(nóng)業(yè)和醫(yī)學(xué)上，亞精胺也有著廣泛的應(yīng)用：在農(nóng)業(yè)上，亞精胺應(yīng)用于調(diào)節(jié)植物生長代謝，抵抗環(huán)境變化帶來的副作用，提高果實(shí)產(chǎn)量與質(zhì)量；在醫(yī)學(xué)上，亞精胺可以作為治療由不同蛋白病變引起的神經(jīng)退行性疾病的潛在開發(fā)藥物。

目前生產(chǎn)亞精胺的方法主要有化學(xué)法、提取法和發(fā)酵法。化學(xué)法以1,4-丁二胺和丙烯腈為原料，通過加成、氫化和還原反應(yīng)得到亞精胺，由于反應(yīng)條件苛刻，殘留的底物難去除，導(dǎo)致提純成本高，限制了亞精胺的工業(yè)化生產(chǎn)；提取法制備亞精胺通常是以谷類物質(zhì)如薏米為原料，經(jīng)碾碎、酸水解(或堿水解，酶水解)后再通過樹脂交換等分離方法收集洗脫液即為亞精胺，由于制作繁瑣，產(chǎn)物純度低導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)品價(jià)格昂貴，不適用于大規(guī)模生產(chǎn)；生物發(fā)酵法主要以葡萄糖或蔗糖作為碳源，通過微生物(釀酒酵母或芽孢桿菌)代謝生成亞精胺，相較于前兩種制備方法，發(fā)酵法產(chǎn)亞精胺具有條件溫和，生產(chǎn)成本低的優(yōu)勢。但該方法也存在限制性因素，如產(chǎn)物量少，菌株產(chǎn)物耐受性差等，因此開發(fā)一種綠色高效的亞精胺生物合成路徑具有重要意義。

體外酶催化的合成方法可通過一步或簡單幾步的酶催化反應(yīng)達(dá)到合成的目的。利用S-腺苷蛋氨酸脫羧酶和亞精胺合酶可以催化S-腺苷蛋氨酸和丁二胺合成亞精胺。S-腺苷蛋氨酸脫羧酶催化S-腺苷蛋氨酸形成脫羧的S-腺苷蛋氨酸，丁二胺與脫羧的S-腺苷蛋氨酸反應(yīng)，在亞精胺合酶的作用下轉(zhuǎn)移其氨基丙基接到丁二胺后形成亞精胺。酶法級聯(lián)催化合成亞精胺存在催化時(shí)間較長的問題，原因是兩種酶都以游離酶的形態(tài)存在，由S-腺苷蛋氨酸脫羧酶形成的脫羧S-腺苷蛋氨酸均勻擴(kuò)散在溶液中，局部濃度較低即中間產(chǎn)物的傳遞存在問題，導(dǎo)致最終的反應(yīng)速率受到限制。

通過構(gòu)建多酶組裝體在多酶之間形成底物通道，可以提高多酶級聯(lián)反應(yīng)的催化效率。例如Zhenjun?Liu等利用SpyTag/SpyCatcher自反應(yīng)系統(tǒng)高效穩(wěn)定的共價(jià)偶聯(lián)特征構(gòu)建了兩種蛋白支架。將酶與蛋白支架用對接蛋白進(jìn)行組裝得到的多酶納米結(jié)構(gòu)有效的提高了甲萘醌生物合成的催化速率和產(chǎn)物產(chǎn)量。細(xì)菌微室的外殼蛋白，在大腸桿菌中過表達(dá)會形成密集的軸向蛋白絲。在體外，同樣可以自組裝形成該結(jié)構(gòu)。可以作為天然的蛋白支架。Guoqiang?Zhang等將乙醇胺利用細(xì)菌微室的外殼蛋白EutM與結(jié)合蛋白SpyCatcher融合表達(dá)構(gòu)建蛋白支架，再將酶與結(jié)合分子肽SpyTag融合表達(dá)后與蛋白支架進(jìn)行組裝。最終形成的蛋白質(zhì)支架多酶組裝系統(tǒng)與游離酶系統(tǒng)相比，提高了手性胺的合成速率。利用粘連蛋白和錨定蛋白之間的相互作用將亞精胺合酶和S-腺苷蛋氨酸脫羧酶連接，雖然構(gòu)建了底物通道，但是在整個(gè)反應(yīng)體系中，SpeE-SpeD雙酶結(jié)合體仍處于游離狀態(tài)，組裝技術(shù)帶來的鄰近優(yōu)勢并未完全發(fā)揮。

發(fā)明內(nèi)容