[發明專利]一種基于CcmK2纖維狀蛋白的亞精胺合成多酶復合體的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 202210672219.0
• 申請日: 2022-06-14
• 公開（公告）號: CN114958894B
• 公開（公告）日: 2023-05-30
• 發明（設計）人: 王昕;胡鑫峰;陳可泉;劉逸;王靖;周彩蓮
• 申請（專利權）人: 南京工業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/31;C12N15/54;C12N15/60;C12P13/00
• 代理公司: 南京擎天知識產權代理事務所(普通合伙) 32465
• 代理人: 藍霞

1.一種基于CcmK2纖維狀蛋白的亞精胺合成多酶復合體的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、蛋白支架CcmK2-linker-SpyCatcher的構建

將纖維狀蛋白CcmK2的C端和結合蛋白SpyCatcher融合表達，構建蛋白支架CcmK2-linker-SpyCatcher，其中，編碼纖維狀蛋白CcmK2的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.1所示，編碼結合蛋白SpyCatcher的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.2所示，在CcmK2的C端融合結合蛋白SpyCatcher，連接兩種蛋白的linker氨基酸序列為：GSGSGSGSGSGS；

步驟2、SpeE-linkerⅠ-CohⅡ-linkerⅡ-SpyTag的構建

將亞精胺合酶SpeE的C端融合粘連蛋白CohesinⅡ形成SpeE-linkerⅠ-CohⅡ，再將SpeE-linkerⅠ-CohⅡ的C端融合結合分子肽SpyTag形成SpeE-linkerⅠ-CohⅡ-linkerⅡ-SpyTag，其中，編碼亞精胺合酶SpeE的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.3所示，編碼粘連蛋白CohesinⅡ的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.4所示，編碼結合分子肽SpyTag的核苷酸序列如SEQID?NO.5所示，連接SpeE和CohesinⅡ兩種蛋白的linkerⅠ氨基酸序列為：GGGGSGGGGS，連接SpeE-linkerⅠ-CohⅡ和SpyTag兩種蛋白的linkerⅡ氨基酸序列為：GSGGSGVD；

步驟3、SpeD-linker-DocⅡ的構建

將S-腺苷蛋氨酸脫羧酶SpeD的C端融合錨定蛋白DockerinⅡ形成SpeD-linker-DocⅡ，其中，編碼S-腺苷蛋氨酸脫羧酶SpeD的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.6所示，編碼錨定蛋白DockerinⅡ的核苷酸序列如SEQ?ID?NO.7所示，融合SpeD和DockerinⅡ所用的linker氨基酸序列為：GGGGSGGGGS；

步驟4、亞精胺合成多酶復合體的胞外自組裝

首先將純化得到的SpeE-linkerⅠ-CohⅡ-linkerⅡ-SpyTag和SpeD-linker-DocⅡ體外自組裝形成SpeE-SpeD雙酶結合體，再將SpeE-SpeD雙酶結合體和蛋白支架CcmK2-linker-SpyCatcher結合形成亞精胺合成多酶復合體。

2.根據權利要求1所述的一種基于CcmK2纖維狀蛋白的亞精胺合成多酶復合體的構建方法，其特征在于，步驟1中纖維狀蛋白CcmK2的基因片段用PCR擴增引物的核苷酸序列為EcoRⅠ-CcmK2-F和CcmK2-linker-R，分別如SEQ?ID?NO.8和SEQ?ID?NO.9所示；結合蛋白SpyCatcher的基因片段用PCR擴增引物的核苷酸序列為linker-SpyCatcher-F和SpyCatcher-HindⅢ-R，分別如SEQ?ID?NO.10和SEQ?ID?NO.11所示；纖維狀蛋白CcmK2的基因片段和結合蛋白SpyCatcher的基因片段用Overlap-PCR技術融合擴增，融合擴增引物的核苷酸序列為EcoRⅠ-CcmK2-F和SpyCatcher-HindⅢ-R，分別如SEQ?ID?NO.8和SEQ?IDNO.11所示。

3.根據權利要求1所述的一種基于CcmK2纖維狀蛋白的亞精胺合成多酶復合體的構建方法，其特征在于，步驟2中亞精胺合酶SpeE的基因片段用PCR擴增引物的核苷酸序列為EcoRⅠ-SpeE-F和SpeE-linkerⅠ-R，分別如SEQ?ID?NO.12和SEQ?ID?NO.13所示；粘連蛋白CohesinⅡ的基因片段用PCR擴增引物的核苷酸序列為linkerⅠ-CohⅡ-F和CohⅡ-linkerⅡ-R，分別如SEQ?ID?NO.14和SEQ?ID?NO.15所示；結合分子肽SpyTag的基因片段用PCR擴增引物的核苷酸序列為linkerⅡ-SpyTag-F和SpyTag-HindⅢ-R，分別如SEQ?ID?NO.16和SEQID?NO.17所示；亞精胺合酶SpeE的基因片段、粘連蛋白CohesinⅡ的基因片段和結合分子肽SpyTag的基因片段用Overlap-PCR技術融合擴增，融合擴增引物的核苷酸序列為EcoRⅠ-SpeE-F和SpyTag-HindⅢ-R，分別如SEQ?ID?NO.12和SEQ?ID?NO.17所示。