[發(fā)明專利]殼寡糖NMR波譜的歸屬方法及脫乙酰度的測定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210664858.2
• 申請日: 2022-06-13
• 公開（公告）號: CN114878624B
• 公開（公告）日: 2023-10-20
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張永勤;呂興霜;鄔雅喃;陳相玉;劉建瑞;劉芳;董靜文;劉銀春;潘文鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 青島科技大學(xué)
• 主分類號: G01N24/08
• 分類號: G01N24/08
• 代理公司: 青島中天匯智知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37241
• 代理人: 韓麗萍

本發(fā)明殼寡糖的核磁分析技術(shù)領(lǐng)域。針對核磁法測定殼寡糖脫乙酰度的技術(shù)存在殼寡糖產(chǎn)品中所添加的乙酸的甲基質(zhì)子峰與殼寡糖的乙酰基的甲基質(zhì)子峰的化學(xué)位移相近，難以歸屬的問題，提供一種殼寡糖NMR波譜的歸屬方法及殼寡糖的脫乙酰度的測定方法：將干燥的殼寡糖樣品分別完全溶解于兩種氘代試劑，氘代試劑1為D₂O或D₂O和NaOD的混合溶液，氘代試劑2為D₂O和DCl的混合溶液；將兩種氘代試劑溶解的殼寡糖樣品的核磁共振譜圖進(jìn)行比較，將化學(xué)位移值變化小的甲基質(zhì)子峰確定為殼寡糖的N?乙酰基的甲基質(zhì)子峰H_AC，將化學(xué)位移值變化大的甲基質(zhì)子峰確定為乙酸的甲基質(zhì)子峰H_A。本發(fā)明的歸屬方法和脫乙酰度的測定方法準(zhǔn)確、簡便。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于殼寡糖的核磁分析技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及殼寡糖NMR波譜的歸屬方法及脫乙酰度的測定方法。

背景技術(shù)

殼寡糖是由氨基葡萄糖和N-乙酰氨基葡萄糖兩種糖單元構(gòu)成，為殼聚糖的降解產(chǎn)物，因此，殼寡糖的分子結(jié)構(gòu)與殼聚糖的類似，只是殼寡糖的平均聚合度已大幅度降低。與殼聚糖相比，殼寡糖具有良好的水溶性，其生物活性如抗菌、抗腫瘤、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)功能等已在醫(yī)藥、化妝品、食品、紡織、造紙等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。殼寡糖也被稱為低聚合度的水溶性殼聚糖，它可溶于酸性、中性和堿性溶液。脫乙酰度(DD)可被定義為氨基葡萄糖單元在殼寡糖分子中所占的平均摩爾百分?jǐn)?shù)。氨基葡萄糖單元是決定殼寡糖生物活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，因此，DD是殼寡糖質(zhì)量控制的重要參數(shù)。

有關(guān)殼聚糖的脫乙酰度測定方法報道較多，但針對殼寡糖的脫乙酰度測定方法卻鮮有報道，究其原因，殼寡糖產(chǎn)品中往往含乙酸和/或鹽酸而影響了DD的準(zhǔn)確測定。殼寡糖產(chǎn)品中含酸的原因主要有以下幾點(diǎn)：1)殼寡糖的分子量較小，單位質(zhì)量所含有的具有還原性的半縮醛基明顯多于殼聚糖，而這些半縮醛基極易與殼寡糖分子中的氨基葡萄糖單元中的氨基發(fā)生美拉德反應(yīng)，為防止殼寡糖變質(zhì)，往往會在殼寡糖產(chǎn)品中添加酸以保護(hù)氨基，以抑制該反應(yīng)進(jìn)行；2)出于綠色、安全、環(huán)保的考慮，殼寡糖絕大部分來源于殼聚糖的酶法降解，其酶解最適pH常需要添加乙酸維持；3)殼聚糖不溶于水，在降解之前需先溶于酸性溶液，降解后的殼聚糖中會有酸殘留；4)殼聚糖只能溶于有限的幾種酸性的稀溶液，從低成本考慮，以稀鹽酸為最佳，但鹽酸為強(qiáng)酸，極易使殼寡糖繼續(xù)降解而降低殼寡糖應(yīng)有的生物活性，因此，在殼寡糖產(chǎn)品中往往會加入成本同樣較低的乙酸。

乙酸的添加對殼寡糖的脫乙酰度的準(zhǔn)確測定帶來極大麻煩，常用于測定殼聚糖的脫乙酰度的方法如元素分析法、電位滴定法、紅外法、紫外法均無法應(yīng)用于殼寡糖的脫乙酰度的測定。元素分析法是基于殼寡糖分子中的碳與氮的含量比(C/N)，而含碳的乙酸則會干擾其測定。紅外法是基于乙酰基的甲基、羰基相關(guān)的振動峰的定量測定，由于酸的存在，殼寡糖分子中的-NH₂部分或全部變?yōu)?NH₃⁺，而這兩種基團(tuán)的N-H彎曲振動完全不同而影響到乙酰基的C＝O伸縮震動峰，因而無法使用殼聚糖的紅外測定法測定殼寡糖的脫乙酰度。電位滴定法是基于對殼寡糖分子中的氨基的測定，由于乙酸是弱酸，而氨基為弱堿，很難觀測到滴定位點(diǎn)而影響氨基含量的測定，再者，殼寡糖往往以部分鹽的形式存在，有可能既有乙酸鹽又有鹽酸鹽，而這些鹽的含量是未知的，給DD值的計算帶來了極大麻煩，此外，該法耗時冗長，檢測效率低，不便于大批量測定。紫外法的測定基于殼寡糖分子中的乙酰基，而殼寡糖產(chǎn)品中所添加的乙酸會直接影響測定結(jié)果，該法更適合于不含乙酸的殼聚糖DD的測定。因此，本行業(yè)只能以殼寡糖樣品中乙酰基的質(zhì)量占比來表示殼寡糖的脫乙酰度，而非殼寡糖分子結(jié)構(gòu)的氨基葡萄糖單元的摩爾占比，而以摩爾占比計量脫乙酰度更能夠體現(xiàn)殼寡糖分子的結(jié)構(gòu)特征。