[發明專利]基于FRET的DNA損傷檢測方法及功能蛋白

在審

• 申請號: 202210657900.8
• 申請日: 2022-06-12
• 公開（公告）號: CN115046973A
• 公開（公告）日: 2022-09-13
• 發明（設計）人: 華躍進;鐘世通;陸慧智;宋爽;王梁燕
• 申請（專利權）人: 浙江大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64;C07K19/00;C12N9/50
• 代理公司: 杭州求是專利事務所有限公司 33200
• 代理人: 林松海

本發明公開了一種基于FRET的DNA損傷檢測方法及功能蛋白。利用耐輻射奇球菌中的阻遏蛋白DdrO，將黃色熒光蛋白eYFP和青色熒光蛋白eCFP分別連接于其N端和C端，構建出具有熒光能量轉移特性的功能蛋白YDC；同時利用能特異性切割DdrO的耐輻射奇球菌損傷響應調控因子PprI蛋白，將PprI蛋白的91號位點的天冬氨酸（D）突變為丙氨酸（A）后得到蛋白PprI?D91A，以降低其不存在單鏈DNA時的酶切活性；當體系中存在損傷產生的單鏈DNA時，PprI?D91A能夠快速地酶切YDC，在440 nm激發光的作用下，YDC發射光的480 nm峰升高且530 nm峰下降；同時還提供了YDC和PprI?D91A的氨基酸序列以及檢測DNA損傷的反應體系。本發明對開發新型分子生物學的工具具有重要指導意義。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，尤其是一種檢測DNA損傷的熒光檢測方法及功能蛋白。

背景技術

目前檢測DNA損傷的方法根據實驗原理可以分為三大類：根據DNA理化性質改變設計的檢測方法、根據分子互作原理設計的檢測方法、以及根據損傷后物質變化設計的檢測方法。單細胞凝膠電泳法（SCGE，也稱為彗星實驗）就是一種根據DNA理化性質改變設計的檢測方法，能有效地測定細胞中DNA單鏈和雙鏈的損傷程度，主要步驟包括封裝、裂解和電泳三步，高pH下電泳形成類似彗星的結構。而DNA斷裂熒光原位雜交（DBD-FISH）是基于分子雜交原理的，利用堿性條件使DNA在斷裂處解旋成單鏈DNA，再利用熒光DNA探針雜交以展示斷裂處。根據物質變化檢測的方法有γ-H2AX檢測法，γ-H2AX為DNA損傷的一個標志物，一旦發生DNA雙鏈斷裂（DSB），就會立即產生γ-H2AX，并且與DSB的數量呈現一一對應的關系，即一個γ-H2AX焦點對應一個DSB位點。

但是在如前所述的DNA損傷檢測方法中，前兩種的處理步驟較為繁瑣，等待時間長，不利于提高實驗效率。最后一種雖然能夠實現特異性很好的損傷檢測，但是依賴于特定蛋白，不利于技術的推廣使用。

最新的研究表明，耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans，DR）采取了與經典細菌SOS系統不同的損傷響應修復途徑——PprI-DdrO途徑，其中發揮關鍵作用的是PprI和DdrO兩個蛋白，并且ssDNA的加入能夠促進其中的酶切過程。

發明內容

為了克服現有DNA損傷檢測技術的不足，本發明的目的是提供一種基于FRET的DNA損傷檢測方法及功能蛋白。

一種基于FRET的DNA損傷檢測方法，步驟如下：

1）配制反應溶液，包括：PprI-D91A、YDC、待測樣品、Buffer；37℃反應30 min；

2）反應完成后吸取反應溶液加入到黑色386孔板中，利用多功能酶標儀，以440 nm波長的光為激發光，掃描460 nm ~ 600 nm波長的發射光，求得530 nm與480 nm發射光的比值R_530/480；

3）將樣品的R_530/480與空白對照的R_530/480作比得到rR_530/480，根據標準曲線方程，得到待測樣品中所含的ssDNA量，據此來評估待測樣品中DNA的損傷程度；

所述的YDC含有eYFP、DdrO和eCFP三個結構區域；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述的PprI-D91A，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的方法，更具體的步驟如下：