[發明專利]基于FRET的DNA損傷檢測方法及功能蛋白在審
| 申請號： | 202210657900.8 | 申請日： | 2022-06-12 |
| 公開（公告）號： | CN115046973A | 公開（公告）日： | 2022-09-13 |
| 發明（設計）人： | 華躍進;鐘世通;陸慧智;宋爽;王梁燕 | 申請（專利權）人： | 浙江大學 |
| 主分類號： | G01N21/64 | 分類號： | G01N21/64;C07K19/00;C12N9/50 |
| 代理公司： | 杭州求是專利事務所有限公司 33200 | 代理人： | 林松海 |
| 地址： | 310058 浙江*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 基于 fret dna 損傷 檢測 方法 功能 蛋白 | ||
1.一種基于FRET的DNA損傷檢測方法，其特征在于，步驟如下：
1）配制反應溶液，包括：PprI-D91A、YDC、待測樣品、Buffer；37℃反應30 min；
2）反應完成后吸取反應溶液加入到黑色386孔板中，利用多功能酶標儀，以440 nm波長的光為激發光，掃描460 nm ~ 600 nm波長的發射光，求得530 nm與480 nm發射光的比值
3）將樣品的
所述的YDC含有eYFP、DdrO和eCFP三個結構區域；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述的PprI-D91A，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟如下：
1）配制反應溶液：PprI-D91A，終濃度0.10 μM；YDC，終濃度3.0 μM；待測樣品10 μL；2mM MnCl2 10 μL；65.7 μL Buffer；ddH2O補齊反應溶液到100 μL，37℃反應30 min；
所述的Buffer：250 mM NaCl、5%甘油、20 mM Tris-HCl pH 7.5；
2）反應完成后吸取70 μL反應溶液加入到黑色386孔板中，利用多功能酶標儀，以440nm波長的光為激發光，掃描460 nm ~ 600 nm波長的發射光，求得530 nm與480 nm發射光的比值
3）將樣品的
3.一種具有熒光能量轉移特性的功能蛋白YDC，其特征在于，所述功能蛋白YDC含有eYFP、DdrO和eCFP三個結構區域；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
4.一種蛋白酶PprI-D91A，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5. 一種基于FRET的功能蛋白組合，其特征在于，包括PprI-D91A和YDC；所述的PprI-D91A，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；
所述的YDC含有eYFP、DdrO和eCFP三個結構區域；氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
PprI-D91A能夠準確識別功能蛋白YDC的特定序列并對其進行酶切，酶切反應后YDC的熒光能量轉移效率降低，ssDNA的加入促進酶切過程的進行。
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