[發(fā)明專利]一種穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的他莫昔芬耐藥細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210654292.5
• 申請日: 2022-06-10
• 公開（公告）號: CN114921493A
• 公開（公告）日: 2022-08-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 陳淑;羅貝·彼特;維杰·潘迪;張熙;木蘭;黃鵬;黃晶;郝俊丞
• 申請（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)深圳國際研究生院
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/53;C12N5/10;C12N5/09;A01K67/027;C12Q1/02
• 代理公司: 北京市誠輝律師事務(wù)所 11430
• 代理人: 范盈;姚幸茹

本發(fā)明公開了一種穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的他莫昔芬耐藥細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用，通過將穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行裸鼠原位異種移植成瘤實驗，裸鼠成瘤后，注射他莫昔芬治療，治療結(jié)束后，取出治療壓力下穩(wěn)定增殖的腫瘤塊，進(jìn)行原代培養(yǎng)，得到他莫昔芬耐藥細(xì)胞株。本發(fā)明還公開一種他莫昔芬耐藥細(xì)胞株CS?MCF7?TR，其保藏編號為CCTCCNO:C2022118。本發(fā)明構(gòu)建方法模擬臨床給藥，循序漸進(jìn)地增大給藥劑量，創(chuàng)新性地從體內(nèi)構(gòu)建他莫昔芬耐藥細(xì)胞模型，且該構(gòu)建方法專一性強(qiáng)。同時，熒光素酶也有利于穩(wěn)定標(biāo)記與活體示蹤，尤其對微小轉(zhuǎn)移灶具有更高敏感性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于腫瘤生物學(xué)和腫瘤治療學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的他莫昔芬耐藥細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

乳腺癌是目前發(fā)病率和死亡率最高的婦科惡性腫瘤，且于2020年發(fā)病率首次取代肺癌成為全球第一大癌癥，占所有新增癌癥患者的11.7％，其中超過50％的乳腺癌患者雌激素受體陽性，該類乳腺癌的治療也成為人們關(guān)注的焦點。傳統(tǒng)的化療和放療由于缺乏特異性，取得療效的同時也往往給患者帶來較大的毒副作用。因此，針對不同分子遺傳學(xué)背景的群體或/和個體，根據(jù)其分子特點進(jìn)行有選擇性的“個體化”治療，以使療效達(dá)到最優(yōu)化，毒性最低化。內(nèi)分泌治療在雌激素受體陽性患者的臨床治療中成為主流療法，且表現(xiàn)出了良好的療效，有力改善患者臨床結(jié)局，但大部分患者在接受內(nèi)分泌治療腫瘤消退后的5年甚至更長時間后出現(xiàn)復(fù)發(fā)，且針對此類晚期乳腺癌患者，他莫昔芬作為其主流臨床的內(nèi)分泌藥物，在改善患者預(yù)后方面非常有限，這類患者通常即使服用藥物，生存期也只有1-2年，臨床結(jié)局不佳。他莫昔芬耐藥是雌激素受體陽性乳腺癌臨床治療的一大挑戰(zhàn)。

目前國內(nèi)尚無模擬臨床體內(nèi)構(gòu)建的他莫昔芬耐藥細(xì)胞株，僅有的耐藥模型并未模擬臨床進(jìn)行耐藥方向的建模，且細(xì)胞株產(chǎn)生多藥耐藥，致使耐藥機(jī)制復(fù)雜，影響因素過多，不利于對單一藥物引起的腫瘤耐藥及轉(zhuǎn)移的研究。

隨著腫瘤研究的深入，應(yīng)用傳統(tǒng)方法(如卡尺測量腫瘤體積、腫瘤組織切片等)進(jìn)行腫瘤研究已存在諸多限制。如進(jìn)行組織切片觀測前需要處死小鼠取出腫瘤組織，因此，在不同時間點或不同實驗組都需要處死一批實驗小鼠以獲取足夠的統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)，這樣不但大大增加了實驗成本，而且很難消除由于小鼠個體差異而產(chǎn)生的誤差，無法獲取可靠的重復(fù)性數(shù)據(jù)，在制作切片時也無法保證實驗的準(zhǔn)確性。另外，微小轉(zhuǎn)移灶也很難被傳統(tǒng)手段檢測到。

熒光素酶(Luciferase)是一類產(chǎn)生生物發(fā)光的氧化酶，可以在實驗室中通過基因工程生產(chǎn)，并被用于多種目的，熒光素酶基因可以被合成并插入到生物體中或轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。在螢光素酶反應(yīng)中，當(dāng)螢光素酶作用于合適的螢光素底物時會發(fā)光，而發(fā)出的光子可以通過光敏設(shè)備，如光度計或改進(jìn)的光學(xué)顯微鏡檢測，這就使得對于生物過程觀察成為可能。由于熒光素酶生物發(fā)光不需要光激發(fā)，因此自發(fā)熒光很小，因此幾乎沒有背景熒光。表達(dá)熒光素酶的細(xì)胞移植到動物身上時，可進(jìn)行全動物體內(nèi)活體成像，是研究活體動物(如小鼠)細(xì)胞群的強(qiáng)大技術(shù)。這種技術(shù)已被應(yīng)用于動物模型中跟蹤腫瘤發(fā)生和腫瘤對治療的反應(yīng)，尤其對微小轉(zhuǎn)移灶具有更高敏感性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明為了解決現(xiàn)有技術(shù)中的不足和缺點，提出一種他莫昔芬耐藥細(xì)胞株及其構(gòu)建方法和應(yīng)用。本發(fā)明通過使用表達(dá)Luciferase的載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MCF7細(xì)胞系并進(jìn)行穩(wěn)定篩選，以表達(dá)此載體的MCF7細(xì)胞系構(gòu)建小鼠來源的細(xì)胞他莫昔芬耐藥模型，可穩(wěn)定標(biāo)記與活體示蹤，用于后期他莫昔芬治療壓力下耐藥轉(zhuǎn)移等方向的深入研究，為開發(fā)內(nèi)分泌治療耐受的雌激素受體陽性乳腺癌患者的新治療策略提供參考。本發(fā)明模擬雌激素受體陽性乳腺癌患者主要內(nèi)分泌藥物他莫昔芬的臨床給藥，創(chuàng)新性地從體內(nèi)構(gòu)建他莫昔芬耐藥模型。

本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：

本發(fā)明第一方面提供一種穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的他莫昔芬耐藥細(xì)胞株的構(gòu)建方法，包括如下步驟：

(1)轉(zhuǎn)染表達(dá)熒光素酶基因的載體進(jìn)入MCF7細(xì)胞，篩選穩(wěn)定表達(dá)熒光素酶基因的MCF7細(xì)胞；