[發明專利]一種BL-CQDs熒光探針的制備方法及其在ACE活性檢測和ACEI篩選的應用

在審

• 申請號: 202210652389.2
• 申請日: 2022-06-08
• 公開（公告）號: CN114958362A
• 公開（公告）日: 2022-08-30
• 發明（設計）人: 湛志華;薛茗月;毛惠會
• 申請（專利權）人: 嶺南師范學院
• 主分類號: C09K11/65
• 分類號: C09K11/65;C01B32/15;B82Y20/00;B82Y40/00;G01N21/64
• 代理公司: 深圳市能聞知識產權代理事務所(普通合伙) 44717
• 代理人: 宋靈劍

本發明公開了一種BL?CQDs熒光探針及其制備方法，以榕樹葉為原料，經萃取和溶劑熱反應制得的碳量子點，簡稱BL?CQDs，晶格間距為0.209nm，具備類石墨烯結構；其微觀形貌呈單分散的均勻球狀分布，平均尺寸為1.6?1.8nm；其表面含有親水性官能團羥基、羰基和醛基；具備單激發雙發射熒光特性。BL?CQDs作為熒光探針具備優良的光學特性、抗光漂白性、pH穩定性、抗鹽穩定性和抗干擾性。公開了一種ACE活性檢測方法，包括以下步驟：a，標準ACE溶液的酶促反應體系的建立；b，酶失活反應體系的建立；c，酶失活反應體系的熒光強度測試。公開了一種ACEI篩選方法，在ACE酶反應體系中加入抑制劑，即可檢測抑制劑的效果；進而獲得了一種血管緊張素轉化酶抑制劑，其抑制率為88.20％。

技術領域

本發明屬于生化分析領域，具體是一種BL-CQDs熒光探針的制備方法及其在ACE活性檢測和ACEI篩選的應用。

背景技術

高血壓是全球心血管疾病發生的主要因素。血管緊張素轉化酶(Angiotensinconverting enzyme，ACE)可以將血管緊張素I(Ang I)水解為血管緊張素II(Ang II)，而Ang II是一種有效的血管收縮劑，當ACE活性升高時，會使水解的Ang II增加，導致血壓升高，因此，ACE成為研發抗高血壓藥物的潛在靶點。分光光度法測定的血清中ACE活性的正常水平為7-25U/L。除了水解Ang I外，ACE還能夠水解許多其他多肽，如P物質、腦啡肽和緩激肽，影響多種生理過程，包括生殖、腎代謝功能、造血和免疫反應。因此，高效、快速地檢測人血清中ACE活性水平對于預防高血壓和發現新的血管緊張素轉化酶抑制劑(Angiotensinconverting enzyme inhibitor，ACEI)至關重要。

ACEI的篩選依賴于相應的酶活性檢測方法。目前，ACE活性的檢測方法主要包括高效液相色譜法、酶偶聯法、高效液相色譜質譜聯用法等。這些方法大都需要通過多個步驟進行樣本處理、操作繁瑣且存在靈敏度較低的問題。此外，這些方法的檢測都需要昂貴的精密設備投入，且檢測中需要消耗大量有機溶劑，成本高且對環境不友好。

現有文獻1(CN1831529A)公開了一種用高效液相色譜和質譜聯用快速篩選血管緊張素轉化酶抑制劑的方法。以馬尿酸雙甘肽或馬尿酸組氨酸亮氨酸為底物，純化的兔肺血管緊張素轉化酶或人空白血漿為血管緊張素轉化酶的來源，在水浴中加熱反應，過濾膜或離心之后，用高效液相色譜對血管緊張素轉化酶反應混合溶液中底物、產物以及所加內標進行分離后，在電噴霧質譜的負離子模式下檢測血管緊張素轉化酶催化底物水解所生成的馬尿酸。

現有文獻2(CN108659099A)公開了一種用于血管緊張素轉化酶活性檢測的質譜探針及其應用，以氨基酸序列為Asp-Ser-Asp-Lys-Pro的多肽及修飾在所述多肽N端的天冬氨酸上的哌嗪類化合物為質譜探針，其作為酶底物，被血管緊張素轉化酶特異性識別，通過質譜測定酶切反應前后的探針或酶切產物的量來檢測血管緊張素轉化酶的活性。

發明內容

經發明人研究發現，可以通過碳量子點(Carbon quantum dots,CQDs)解決上述問題。CQDs除了具有獨特的光學性質外，還因為主要含有碳元素而表現出很低的細胞毒性以及良好的生物相容性，從而促使碳點在生物領域如生物細胞標記、生物成像、生物檢測、疾病診斷、藥物釋放應用方面的應用。因此基于CQD發展生物相容性良好的低毒性新型熒光納米材料，并構建穩定性好、靈敏度高的熒光納米探針以檢測ACE活性是一個新思路。

在此基礎上，利用ACE催化特定底物馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)生成的產物馬尿酸(Hip，Hippuric acid，HA)，通過檢測BL-CQDs熒光探針與HA結合后的熒光強度的變化，可以實現間接反應檢測ACE的活性。

本發明的發明目的包括：

1、提供一種BL-CQDs熒光探針及其制備方法；