[發(fā)明專利]一種計數(shù)秀麗隱桿線蟲子宮內(nèi)發(fā)育胚胎數(shù)目的方法

有效

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• 申請日: 2022-06-09
• 公開（公告）號: CN114794029B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發(fā)明（設計）人: 李輝;王晨;史崇麗;李葉勇;曾令君;彭怡
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;C12N1/20;G01N15/10
• 代理公司: 北京律譜知識產(chǎn)權代理有限公司 11457
• 代理人: 孟德洲

本發(fā)明涉及一種計數(shù)秀麗隱桿線蟲子宮內(nèi)發(fā)育胚胎數(shù)目的方法。該發(fā)明方法以秀麗隱桿線蟲作為模式生物，設計了一整套實驗流程檢測計數(shù)秀麗隱桿線蟲子宮內(nèi)的胚胎數(shù)目。該發(fā)明方法能夠使線蟲蟲體透明，并將孕蟲體內(nèi)不方便計數(shù)的胚胎完全暴露出來，從而便于在普通光學體視顯微鏡下計數(shù)胚胎數(shù)目。本發(fā)明方法適用于從L1期開始暴露，最終狀態(tài)處于孕期的秀麗隱桿線蟲。本發(fā)明方法可為利用秀麗隱桿線蟲研究生殖能力，尤其是以子宮內(nèi)胚胎數(shù)目為指標的毒理、藥理研究提供易于觀察、快速簡便、準確可靠的實驗方法，檢測結(jié)果具有較高的準確性和可靠性，適合推廣使用。

技術領域

本發(fā)明屬于生物技術領域，具體涉及一種秀麗隱桿線蟲子宮內(nèi)發(fā)育胚胎數(shù)目計數(shù)方法。

背景技術

秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans)是一種非寄生線蟲，由于其易于培養(yǎng)，身體半透明，生命周期短，具有完整的基因組測序數(shù)據(jù)庫，是一種理想的研究用模式生物。大部分秀麗隱桿線蟲是雌雄同體，具有完整的生殖結(jié)構，包括兩個性腺臂、兩個精囊、一個子宮，可通過自體受精進行繁殖，是生物醫(yī)藥、環(huán)境毒理等學科中生殖效應研究經(jīng)典模型。通常情況下，用于研究秀麗隱桿線蟲生殖相關生理研究指標包括生殖腺凋亡、生殖器形態(tài)、子宮內(nèi)發(fā)育胚胎數(shù)目、卵母細胞形態(tài)和數(shù)目、精子形態(tài)和數(shù)目、產(chǎn)卵數(shù)目、卵孵化率等。

由于秀麗隱桿線蟲孕期結(jié)構有發(fā)育完整的生殖腺、子宮、腸道等，遮擋了線蟲體內(nèi)部分胚胎，導致直接觀察孕蟲體內(nèi)胚胎數(shù)目不夠準確。另外，由于秀麗隱桿線蟲在顯微鏡下蠕動速度較快，導致線蟲子宮內(nèi)發(fā)育的胚胎形態(tài)和數(shù)目很難觀察清楚，無法準確計數(shù)每條線蟲子宮內(nèi)的胚胎數(shù)目，從而導致生殖效應評估誤差較大，結(jié)果不夠準確。因此，需要考慮在短時間內(nèi)不影響胚胎形態(tài)和質(zhì)量的情況下，將秀麗隱桿線蟲孕蟲蟲體進行進一步透明化后，記錄胚胎形態(tài)或數(shù)目。

秀麗隱桿線蟲卵孵化后的正常生長周期為：L1期，L2期，L3期，L4期，青年期，成年期。一般秀麗隱桿線蟲暴露因素處理從L1時期開始，而胚胎數(shù)目觀察時間為孕期(即顯微鏡下觀察到秀麗隱桿線蟲子宮內(nèi)有胚胎的成年期)。因此基于以上條件，設計了一套用于計數(shù)秀麗隱桿線蟲子宮內(nèi)發(fā)育胚胎數(shù)目的實驗流程。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種計數(shù)秀麗隱桿線蟲子宮內(nèi)發(fā)育胚胎數(shù)目的方法。本發(fā)明主要采用NaClO溶液對秀麗隱桿線蟲進行預處理，利用NaClO的強氧化性，溶解孕蟲身體中蛋白質(zhì)大分子，使秀麗隱桿線蟲蟲體透明化甚至完全溶解，且短時間內(nèi)蟲卵結(jié)構和形態(tài)不會被破壞，從而將成蟲子宮內(nèi)發(fā)育的胚胎完全釋放和暴露出來，便于在體視顯微鏡下觀察胚胎形態(tài)并計數(shù)胚胎數(shù)目。本發(fā)明檢測周期短、操作簡單快速，有效提高了秀麗隱桿線蟲生殖指標中子宮內(nèi)胚胎數(shù)目評估的準確性和可靠性。

本發(fā)明的技術方案提供了一種計數(shù)秀麗隱桿線蟲子宮內(nèi)發(fā)育胚胎數(shù)目的方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

步驟1、制備大腸桿菌菌液；選用新鮮制備的大腸桿菌E.coli OP50作為秀麗隱桿線蟲食物，根據(jù)用途將大腸桿菌分成兩種，一種用于涂布NGM培養(yǎng)基，另一種在TPHP暴露時用于每日喂食秀麗隱桿線蟲；

該步驟1中，NGM培養(yǎng)基配制方法為：1L去離子水中加入3g NaCl，17g瓊脂，2.5g蛋白胨，0.111g CaCl₂，0.24g MgSO₄，攪拌溶解，121℃滅菌25min；滅菌結(jié)束后，將培養(yǎng)基冷卻至55-60℃后加入1mL膽固醇溶液，25mL磷酸鉀緩沖溶液，攪拌混勻，用蠕動泵分裝15mL培養(yǎng)基到7cm培養(yǎng)皿中，待室溫冷卻凝固后為NGM培養(yǎng)基；

其中，膽固醇溶液用無水乙醇配制，濃度為5mg/mL；磷酸鉀緩沖溶液配制方法為每100mL超純水中加入10.83g KH₂PO₄，4.7g K₂HPO₄，攪拌溶解，121℃滅菌25min；