[發明專利]一種計數秀麗隱桿線蟲子宮內發育胚胎數目的方法

有效

• 申請號: 202210650976.8
• 申請日: 2022-06-09
• 公開（公告）號: CN114794029B
• 公開（公告）日: 2023-02-28
• 發明（設計）人: 李輝;王晨;史崇麗;李葉勇;曾令君;彭怡
• 申請（專利權）人: 上海大學
• 主分類號: A01K67/033
• 分類號: A01K67/033;C12N1/20;G01N15/10
• 代理公司: 北京律譜知識產權代理有限公司 11457
• 代理人: 孟德洲

1.一種計數秀麗隱桿線蟲子宮內發育胚胎數目的方法，其特征在于：具體包括以下步驟：

步驟1、制備大腸桿菌菌液；選用新鮮制備的大腸桿菌E.coli OP50作為秀麗隱桿線蟲食物，根據用途將大腸桿菌分成兩種，一種用于涂布NGM培養基，另一種在TPHP暴露時用于每日喂食秀麗隱桿線蟲；

該步驟1中，NGM培養基配制方法為：1L去離子水中加入3gNaCl，17g瓊脂，2.5g蛋白胨，0.111g CaCl₂，0.24g MgSO₄，攪拌溶解，121℃滅菌25min；滅菌結束后，將培養基冷卻至55-60℃后加入1mL膽固醇溶液，25mL磷酸鉀緩沖溶液，攪拌混勻，用蠕動泵分裝15mL培養基到7cm培養皿中，待室溫冷卻凝固后為NGM培養基；

其中，膽固醇溶液用無水乙醇配制，濃度為5mg/mL；磷酸鉀緩沖溶液配制方法為每100mL超純水中加入10.83g KH₂PO₄，4.7g K₂HPO₄，攪拌溶解，121℃滅菌25min；

步驟2、大腸桿菌涂布；用移液槍吸取適量用于涂布的大腸桿菌于NGM培養基表面，隨后，用滅菌后的涂布棒或試管底部將大腸桿菌在培養皿中央涂勻；待大腸桿菌完全附著在NGM培養基，形成一層薄膜后，將其倒置放入20℃避光生化培養箱中備用；

步驟3、秀麗隱桿線蟲培養；將適量秀麗隱桿線蟲接種到帶有大腸桿菌的NGM培養基表面，每日觀察秀麗隱桿線蟲的生長狀態，若大腸桿菌被消耗完畢，及時更換培養基，直至大部分秀麗隱桿線蟲處于孕期狀態；

步驟4、秀麗隱桿線蟲裂解；將培養至孕期的秀麗隱桿線蟲用K液從培養皿中沖洗至1.5mL離心管中，清洗3次，離心去掉上清液；在離心管中加入1mL裂解液，劇烈渦旋1.5min；隨后，再次離心棄掉上清，加入裂解液，劇烈渦旋至孕蟲完全裂解、蟲卵完全暴露為止；收集蟲卵，清洗3-5遍，去除殘余裂解液；

步驟5、秀麗隱桿線蟲同期化；將蟲卵滴加到不含大腸桿菌的NGM培養基上20℃避光培養16-20h，此時秀麗隱桿線蟲處于L1時期，用K液沖洗該時期的秀麗隱桿線蟲至1.5mL離心管中，清洗3次；

步驟6、配制暴露溶液；準確稱取0.1000g TPHP固體，用二甲基亞砜溶解至10g/L，隨后用二甲基亞砜再次將TPHP稀釋成濃度為10、100、1000、5000mg/L的TPHP溶液，作為母液備用；二甲基亞砜作為空白對照組母液；將母液進一步用K液稀釋100倍，再用K+溶液稀釋100倍，最終得到TPHP濃度為0、1、10、100、500μg/L的秀麗隱桿線蟲暴露溶液；

步驟7、秀麗隱桿線蟲在TPHP溶液中暴露；將準備好的TPHP暴露液加到無菌6孔板中，每孔加5mL；隨后將同期化后處于L1時期的秀麗隱桿線蟲均勻加入6孔板，每日喂食大腸桿菌100μg/L，培養72h；

步驟8、秀麗隱桿線蟲暴露階段選擇；TPHP暴露結束后，將秀麗隱桿線蟲轉移到含有大腸桿菌E.coli OP50的NGM培養基中培養至孕期，之后再取出孕期秀麗隱桿線蟲至1.5mL離心管中，用K液清洗3次；

步驟9、配制NaClO溶液；采用有效含氯量為5.5-6.5％的NaClO，按照體積比NaClO：K液＝1:4的比例稀釋成實驗用NaClO溶液備用；

步驟10、秀麗隱桿線蟲透明化處理；將配置好的NaClO溶液加入無菌24孔板中，每孔加入1mL；隨后向每孔內加入10-20條秀麗隱桿線蟲，室溫靜置5min后，每隔2min觀察秀麗隱桿線蟲狀態，直至線蟲蟲體呈現透明；

步驟11、秀麗隱桿線蟲子宮內胚胎數目計數；將含有透明化秀麗隱桿線蟲的24孔板置于光學體視顯微鏡下，計數每條秀麗隱桿線蟲暴露的胚胎數目并計數；

步驟12、數據分析；數據分析采用SPSS軟件，設置樣本置信區間為95％，計算不同處理組線蟲體內發育胚胎數目的組內平均值、平均誤差。

2.根據權利要求1所述的計數秀麗隱桿線蟲子宮內發育胚胎數目的方法，其特征在于：該步驟1中：

第一種用于涂布NGM培養基的制備方法是將單克隆大腸桿菌接種于LB培養液中，37℃、150rpm避光培養16-20h；

第二種每日喂食秀麗隱桿線蟲的大腸桿菌制備方法是將第一種大腸桿菌菌液12000rpm離心10min，此時大腸桿菌在離心管底部，棄掉上清液，并按照原有上清液：K液(v:v)＝1:1進行替換。