[發(fā)明專利]一種TIGIT基因干擾的嵌合抗原受體NK細(xì)胞及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210639709.0
• 申請(qǐng)日: 2022-06-08
• 公開（公告）號(hào): CN114836428A
• 公開（公告）日: 2022-08-02
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 江文正;張穎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 華東師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N15/12
• 分類號(hào): C12N15/12;C12N15/113;C12N15/867;C12N15/62;C12N5/10;A61K39/00;A61P35/00
• 代理公司: 上海麥其知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31257
• 代理人: 董紅曼

1.一種TIGIT基因RNAi靶序列，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1、5、6所示。

2.一種基于如權(quán)利要求1所述TIGIT基因RNAi靶序列的干擾序列，其特征在于，其序列如SEQ ID NO.2、3、7、8、9、10所示。

3.如權(quán)利要求2所述的干擾序列的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法為，5端以G開頭，設(shè)定G+C含量為30％～50％；根據(jù)pLL3.7載體的要求，包括如下步驟：

(1)在正義鏈5’端加T重建U6啟動(dòng)子l位的T；

(2)干擾靶序列后加Loop環(huán)“TTCAAGAGA”；

(3)加入反轉(zhuǎn)互補(bǔ)序列及終止信號(hào)“TTTTTT”；

(4)在3’端再加上EcoR I酶切位點(diǎn)GAATTC以方便鑒定；

(5)再補(bǔ)平Xho I酶切位點(diǎn)合成一對(duì)互補(bǔ)片段。

4.一種載體，其特征在于，其包含如權(quán)利要求2所述的干擾序列。

5.一種表達(dá)載體質(zhì)粒，其特征在于，其為pLL3.7-TIGIT-shRNA-NKG2D-CAR表達(dá)載體質(zhì)粒。

6.一種表達(dá)載體質(zhì)粒的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

(1)將NKG2D蛋白的胞外段基因序列加入CD8a信號(hào)肽的序列，經(jīng)過(guò)RT-PCR方式擴(kuò)增得到如SEQ ID NO.4所示的Sig-NKG2D胞外段序列；

(2)將所述sig-NKG2D胞外段序列通過(guò)重疊PCR方式連接到二代CAR(4-1B-CD3ζ)，獲得pLL3.7-NKG2D-CAR載體；

(3)將如權(quán)利要求2所述的干擾序列連接到所述pLL3.7-NKG2D-CAR載體上，得到所述pLL3.7-TIGIT-shRNA-NKG2D-CAR表達(dá)載體質(zhì)粒。

7.一種細(xì)胞，其特征在于，其包括如權(quán)利要求1所述的TIGIT基因RNAi靶序列、如權(quán)利要求2所述的基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干擾序列、或如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體質(zhì)粒。

8.一種TIGIT基因干擾的嵌合抗原受體NK細(xì)胞，其特征在于，通過(guò)RNA干擾(RNAi)手段對(duì)TIGIT基因進(jìn)行干擾，敲低TIGIT表達(dá)量；所述干擾序列如SEQ ID NO.2、3、7、8、9、10所示，對(duì)嵌合抗原受體NK細(xì)胞進(jìn)行改造。

9.一種試劑盒、藥物組合物或制劑，其特征在于，其包括如權(quán)利要求1所述的TIGIT基因RNAi靶序列、如權(quán)利要求2所述的基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干擾序列、或如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體質(zhì)粒、如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞。

10.如權(quán)利要求1所述的TIGIT基因RNAi靶序列、如權(quán)利要求2所述的基于所述TIGIT基因RNAi靶序列的干擾序列、如權(quán)利要求5所述的表達(dá)載體質(zhì)粒、如權(quán)利要求7所述的細(xì)胞、如權(quán)利要求9所述的試劑盒或藥物組合物或制劑在制備治療CAR-NK的藥物中的應(yīng)用、在制備治療實(shí)體瘤疾病的藥物中的應(yīng)用、在制備惡性腫瘤疾病免疫治療藥物中的應(yīng)用、在制備靶向治療胰腺癌的藥物中的應(yīng)用、在制備提高NKG2D-CAR-NK細(xì)胞的活化水平的藥物中的應(yīng)用、在制備增強(qiáng)NKG2D-CAR-NK細(xì)胞腫瘤細(xì)胞殺傷能力的藥物中的應(yīng)用。

11.如權(quán)利要求10的應(yīng)用，其特征在于，所述應(yīng)用包括在體外、在體內(nèi)。

12.一種非診斷和/或治療目的的增強(qiáng)NKG2D-CAR-NK細(xì)胞腫瘤細(xì)胞殺傷能力的方法，其特征在于，其通過(guò)敲低TIGIT以提高NKG2D-CAR-NK細(xì)胞的活化水平，增強(qiáng)其對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷能力。

13.一種用于非治療目的的抑制細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)基因的表達(dá)的方法，其特征在于，其包括將如權(quán)利要求2所述的干擾序列導(dǎo)入所述細(xì)胞內(nèi)的步驟，或使如權(quán)利要求2所述的干擾序列在所述細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的步驟。