[發(fā)明專利]一種膽綠素還原酶突變體及其編碼基因和應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210638772.2
• 申請日: 2022-06-08
• 公開（公告）號: CN115044565B
• 公開（公告）日: 2023-05-09
• 發(fā)明（設計）人: 余允東;周嘉瑩;戴維;何家洛
• 申請（專利權）人: 中山俊凱生物技術開發(fā)有限公司
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P17/16;C12R1/19
• 代理公司: 廣東金穗知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 44852
• 代理人: 趙李娜

本發(fā)明公開了一種膽綠素還原酶突變體及其編碼基因和應用。所述的膽綠素還原酶突變體的氨基酸序列與SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列相比，在SEQ?ID?NO:2所示的氨基酸序列的第151位、第226位、第228位進行單點突變。所述的膽綠素還原酶突變體可用于膽紅素的合成制備，將其作為生物催化劑轉(zhuǎn)化底物膽綠素生成膽紅素，反應后產(chǎn)物經(jīng)驗證，反應轉(zhuǎn)化率95％。本發(fā)明構建的膽綠素還原酶突變體與野生型酶相比，催化活性顯著提高，能顯著降低酶的使用量，有利于實現(xiàn)生產(chǎn)成本下降及利潤提高，進而有效提高膽綠素還原酶在工業(yè)上的應用價值。

技術領域

本發(fā)明涉及生物酶工程技術領域，具體涉及一種膽綠素還原酶突變體及其編碼基因和應用。

背景技術

膽紅素(bilirubin，CAS號635-65-4)是一種膽色素，主要由血紅素(heme，CAS號14875-96-8)降解產(chǎn)生。膽紅素是牛黃的主要成分之一，牛黃是珍稀名貴中藥材，具有極高的藥用價值，在我國藥用已有二千多年歷史，是世界上公認的珍貴稀有藥料。以牛黃配制的中成藥方有180多個品種，如日本的救心丹、我國的安宮牛黃丸等。但是天然牛黃來源稀少，為了緩解天然牛黃藥源短缺，我國藥學工作者在上個世紀70年代根據(jù)天然牛黃的成分，成功地研制出人工牛黃。但是，人工牛黃粉膽紅素含量太低(僅0.7％)，遠遠低于天然牛黃35％的含量標準，效果自然也存在差異，因此提高膽紅素的含量和純度有利于提高人工牛黃的品質(zhì)。此外，膽紅素也是藥典記載的100多種中成藥制劑的主要成份，具有鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)驚、解熱、降壓等作用。

目前，膽紅素基本都是從動物膽汁中提取，但膽汁中天然膽紅素含量相當?shù)停缲i膽汁中的膽紅素含量僅為0.05％左右，由于原料來源受到限制，所以國內(nèi)開發(fā)活豬造瘺引流膽汁的技術，該技術雖然解決了膽汁來源的問題，但是涉及的動物倫理問題引起很大的社會爭議，因此該應用受到限制，開發(fā)非動物膽汁來源的膽紅素生產(chǎn)方法具有重要經(jīng)濟價值和社會意義。

膽綠素還原酶(biliverdin?reductase，簡稱BvdR，EC?1.3.1.24)是在血紅素代謝中，催化膽綠素還原生成膽紅素的酶，因此膽綠素還原酶可用于生物轉(zhuǎn)化膽綠素制備膽紅素。膽綠素還原酶可通過從動物肝臟直接提取的方法獲得，但這種方法制備的膽綠素還原酶成本高，且活性不夠理想，限制了其在膽紅素工業(yè)化生產(chǎn)中的應用。因此，采用基因工程的方法制備膽綠素還原酶是當前經(jīng)濟有效的辦法之一。

例如中國專利CN113186235A公開了一種生物轉(zhuǎn)化法合成膽紅素的方法，是以表達膽綠素還原酶的基因重組大腸桿菌細胞為生物催化劑，以膽綠素為底物生物轉(zhuǎn)化合成膽紅素。富含膽紅素的大腸桿菌菌體作為膽紅素提取的原料，克服了從動物膽汁中提取膽紅素原料來源不足的問題。

蛋白質(zhì)三維結構模擬和蛋白定向進化技術，是近年來發(fā)展起來的對原始基因序列進行人工改造、以滿足工業(yè)化應用需求的高科技技術，其中蛋白定向進化技術更是獲得了2018年諾貝爾化學獎。因此結合蛋白質(zhì)三維結構模擬和蛋白定向進化技術，進一步尋找和開發(fā)新的具有更高酶活性、適用于工業(yè)大規(guī)模生產(chǎn)的膽綠素還原酶是目前研究的方向之一。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術存在的不足，本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種膽綠素還原酶突變體，以解決現(xiàn)有膽綠素還原酶活性不理想，難以實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)的問題。本發(fā)明利用生物信息分析膽綠素還原酶的三維結構，模擬分子間對接相互作用，找出酶蛋白的活性或特性具有關鍵性的氨基酸，并針對這些特定氨基酸進行定向突變來提高酶活性，將有利于實現(xiàn)生產(chǎn)成本下降及利潤提高，進而有效提高膽綠素還原酶在工業(yè)上的應用價值。

為解決上述技術問題，本發(fā)明提供以下技術方案：