[發(fā)明專利]一種大腸桿菌全局調(diào)控因子環(huán)腺苷酸受體蛋白突變體、基因工程菌及應(yīng)用

有效

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• 申請日: 2022-06-01
• 公開（公告）號: CN114957413B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 吳綿斌;袁東旭;馮磊磊
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江大學(xué)
• 主分類號: C07K14/245
• 分類號: C07K14/245;C12N15/31;C12N1/21;C12P7/18;C12R1/19
• 代理公司: 杭州天勤知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 33224
• 代理人: 沈金龍

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌全局調(diào)控因子環(huán)腺苷酸受體蛋白突變體、基因工程菌及應(yīng)用。本發(fā)明對大腸桿菌全局調(diào)控因子CRP蛋白進(jìn)行改造，對野生型CRP結(jié)合口袋的五個關(guān)鍵位點(diǎn)144，112，127，128，83位氨基酸進(jìn)行組合突變，將112位氨基酸I突變?yōu)長、127位T突變?yōu)镮、144位A突變?yōu)門，83位氨基酸S突變?yōu)镠、128位S突變?yōu)镻時，有效提高了木糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率和木糖醇生產(chǎn)速率，突變株進(jìn)行20L發(fā)酵罐發(fā)酵，41h生產(chǎn)的木糖醇濃度為175.01g/L，木糖醇時空產(chǎn)率4.32g/L/h，木糖轉(zhuǎn)化率100％。本發(fā)明還通過CRP蛋白的全局調(diào)控，提高了菌株對半纖維素水解液中主要毒性物質(zhì)，尤其是大分子色素和乙酸鹽的耐受性，突變株利用水解液發(fā)酵的最大OD₆₀₀可達(dá)140。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種大腸桿菌全局調(diào)控因子環(huán)腺苷酸受體蛋白突變體、基因工程菌及應(yīng)用。

背景技術(shù)

木質(zhì)纖維素生物質(zhì)是地球上最豐富、最廉價的可再生資源，隨著化石燃料等不可再生資源的日益枯竭，可再生資源的開發(fā)利用逐漸受到人們的重視，利用生物質(zhì)資源生產(chǎn)生物基化學(xué)品和燃料是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。木質(zhì)纖維素包括纖維素、半纖維素和木質(zhì)素，其中利用纖維素生產(chǎn)燃料乙醇研究已經(jīng)很成熟并有工業(yè)化生產(chǎn)實例；木質(zhì)素由于成分較為復(fù)雜，研究較為緩慢，并沒有取得重大進(jìn)展；約占木質(zhì)纖維素原料5％～30％的半纖維研究正引起人們的廣泛關(guān)注。半纖維素的主要成分是木聚糖，其經(jīng)過簡單的酸解就能獲得木糖，利用木糖生產(chǎn)木糖醇從碳元素利用而言，是原料利用率最高的途徑之一。木糖醇是來源于木糖的附加值最高、市場需求最大的化學(xué)品。木糖醇是一種五碳糖醇，其甜度與蔗糖相當(dāng)，熱量值卻只有其60％左右，木糖醇具有抗齲齒及代謝不依賴胰島素、改善肝功能等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥和化工行業(yè)；2004年美國能源部從300多種候選化學(xué)品中篩選出12個最具應(yīng)用前景的來源于生物質(zhì)的基礎(chǔ)化學(xué)品，木糖醇就是其中之一。

生物法生產(chǎn)木糖醇相較于化學(xué)法具有原料預(yù)處理簡單、轉(zhuǎn)化效率高、“三廢”排放少等優(yōu)點(diǎn)，已越來越引起人們的興趣。但是生物法的產(chǎn)業(yè)化還存在一些瓶頸，如微生物對半纖維素水解液中的混合糖利用存在相互阻遏的現(xiàn)象，影響混合糖的同步利用；以及未脫毒的玉米芯稀硫酸水解液中含有多種毒性物質(zhì)，主要包括色素、弱酸以及呋喃衍生物三大類，從而導(dǎo)致細(xì)胞生長與生物催化受到抑制。因此，開發(fā)木糖轉(zhuǎn)運(yùn)速率快，且抗逆性強(qiáng)的微生物菌株對于生物法生產(chǎn)木糖醇的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用至關(guān)重要。

申請人在公開號為CN104789586A的發(fā)明專利申請中公開了一種5拷貝木糖還原酶整合于大腸桿菌基因組IS5序列上的基因工程菌IS5-5，該菌株以純木糖為底物，采用15-L罐進(jìn)行補(bǔ)料-分批發(fā)酵，100h生產(chǎn)了180.74g/L的木糖醇。

申請人在公開號為CN110734479A的發(fā)明專利申請中公開了一種將大腸桿菌的環(huán)腺苷酸受體蛋白(CRP)112位氨基酸I突變?yōu)長、127位T突變?yōu)镚、144位A突變?yōu)門獲得的基因工程菌IS5-5G，該菌株以未經(jīng)離子交換脫毒的玉米芯水解液為原料，采用15-L罐分批補(bǔ)料進(jìn)行發(fā)酵，78h生產(chǎn)了136.7g/L的木糖醇，生產(chǎn)速率為1.75g/L，木糖醇對木糖的收率為1.0g/g。

雖然，IS5-5G菌株有效緩解了大腸桿菌對混合糖依次利用的代謝產(chǎn)物阻遏效應(yīng)(CCR)效應(yīng)，能夠利用未經(jīng)離子交換脫毒的半纖維素水解液發(fā)酵生產(chǎn)木糖醇。然而其發(fā)酵周期較長，木糖醇產(chǎn)量和時空產(chǎn)率仍有待提高。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明對大腸桿菌全局調(diào)控因子CRP進(jìn)行改造，在消除CCR效應(yīng)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步提高了工業(yè)菌株對纖維素水解液中主要毒性物質(zhì)的耐受性，克服了對水解液耐受性表型與基因型復(fù)雜關(guān)系認(rèn)識的不足，實現(xiàn)了從全局水平上強(qiáng)化工程菌的目標(biāo)性能。本發(fā)明的目的在于提供一種大腸桿菌全局調(diào)控因子環(huán)腺苷酸受體蛋白突變體、基因工程菌及應(yīng)用，提供一種大腸桿菌CRP突變株的構(gòu)建方法，以及該突變株在提高對纖維素水解液中主要毒性物質(zhì)耐受性方面的作用。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下：