[發(fā)明專利]細(xì)胞因子融合蛋白的ADA分析方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210630417.0
• 申請(qǐng)日: 2022-06-06
• 公開（公告）號(hào): CN115078730A
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 戴佳珍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 蘇州方達(dá)新藥開發(fā)有限公司
• 主分類號(hào): G01N33/68
• 分類號(hào): G01N33/68;G01N33/53
• 代理公司: 重慶百潤洪知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 50219
• 代理人: 陳付玉

本發(fā)明涉及生物檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及細(xì)胞因子融合蛋白的ADA分析方法，通過以下步驟實(shí)現(xiàn)：將樣品酸化處理；將酸化樣品經(jīng)中和后在抗原包被的酶標(biāo)板上孵育，形成Drug?ADA免疫復(fù)合物；將Drug?ADA免疫復(fù)合物從酶標(biāo)板上酸化洗脫；將洗脫物與Master?mixture工作液孵育，形成Biotin?Drug?ADA?Drug?Sulfo復(fù)合物；將Biotin?Drug?ADA?Drug?Sulfo復(fù)合物加至MSD板上孵育；測量與MSD板結(jié)合的復(fù)合物的可檢測發(fā)光信號(hào)。本發(fā)明靈敏度高，重復(fù)性更好，藥物耐受性更好，為新藥開發(fā)、治療手段及免疫原性分析提供了指導(dǎo)意義，降低企業(yè)研發(fā)新藥的風(fēng)險(xiǎn)和成本。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測分析技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及細(xì)胞因子融合蛋白的ADA分析方法。

背景技術(shù)

免疫原性是藥物研發(fā)過程中必不可少的一部分，需要在臨床前和臨床階段均開展。細(xì)胞因子融合蛋白是一類分子量大的藥物，具有較強(qiáng)的免疫原性。免疫原性除了與藥物的結(jié)構(gòu)有關(guān)，還與給藥途徑、劑量和頻率有關(guān)。具有免疫原性的藥物可能誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生有害的免疫反應(yīng)，形成抗藥抗體(ADA)。ADA會(huì)引起患者強(qiáng)烈的免疫反應(yīng)，出現(xiàn)過敏、應(yīng)激等，甚至危害人的生命安全。免疫原性是藥物研發(fā)過程中必不可少的一部分，需要在臨床前和臨床階段均開展。抗藥物抗體(ADA)在樣品中會(huì)有兩種存在形式，即游離ADA和ADA與藥物的復(fù)合物(ADA-Drug)。

目前，對(duì)于已報(bào)道ADA的檢測方法常用ELISA橋接法，其主要步驟為：將 Biotin-Drug、ADA加入至藥物包被的96孔酶標(biāo)板中進(jìn)行孵育，洗板后在板中加入SA-HRP進(jìn)行孵育，洗板后加入TMB顯色，最后用2N H2SO4終止反應(yīng)，用酶標(biāo)儀讀取信號(hào)值。

專利CN202110295274.8公開了免疫復(fù)合物檢測方法，采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)檢測ADA，包括包被、洗板、封閉、洗板、加樣、洗板、加HRP、洗板、顯色、加終止液、讀板的步驟。其實(shí)驗(yàn)步驟復(fù)雜，重復(fù)性差，藥物耐受性差，檢測范圍和靈敏度都較低，不能檢測到低親和力的抗體。此外，ELISA 方法需要使用硫酸作為反應(yīng)終止液，硫酸具有較強(qiáng)的腐蝕性，使用不當(dāng)會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)人員的安全和環(huán)境造成危害。

專利CN201810130235.0公開了一種去除抗藥抗體樣品中游離藥物的裝置和方法，該發(fā)明需要先將抗體進(jìn)行純化，再將抗體偶聯(lián)至瓊脂糖樹脂上，形成固相載體。樣品中的游離藥物通過與偶聯(lián)的抗體結(jié)合反應(yīng)而吸附在固相載體上，從而去除ADA樣品中的游離藥物。實(shí)驗(yàn)過程需要純化抗體和制備瓊脂糖柱，實(shí)驗(yàn)成本高。

細(xì)胞因子是由免疫細(xì)胞和某些非免疫細(xì)胞經(jīng)刺激而合成、分泌的一大類多功能、高活性的生物物質(zhì)。細(xì)胞因子融合蛋白是現(xiàn)今免疫學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)方向。它是利用基因工程技術(shù)將不同的基因或基因片段融合在一起，經(jīng)過表達(dá)后可以由不同的功能細(xì)胞因子拼合在一起而形成的融合蛋白，可以優(yōu)化蛋白性能，甚至產(chǎn)生新功能。細(xì)胞因子融合蛋白具有極高的應(yīng)用價(jià)值和可觀的治療前景。因此，檢測細(xì)胞因子融合蛋白ADA能夠判斷藥物的有效性和安全性，為新藥開發(fā)、治療手段及免疫原性分析提供指導(dǎo)意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)以上述背景技術(shù)的不足，本發(fā)明提供一種高靈敏度、重復(fù)性好、藥物耐受性好、實(shí)驗(yàn)步驟簡單安全的細(xì)胞因子融合蛋白的ADA分析方法，解決了 ELISA法。

本發(fā)明提供細(xì)胞因子融合蛋白的ADA分析方法，關(guān)鍵在于：包括以下步驟：

S1.將樣品酸化處理；

S2.將酸化樣品經(jīng)中和后在抗原包被的酶標(biāo)板上孵育，形成Drug-ADA免疫復(fù)合物；

S3.將Drug-ADA免疫復(fù)合物從酶標(biāo)板上酸化洗脫；

S4.將洗脫物與Master-mixture工作液孵育，形成Biotin-Drug-ADA-Drug-Sulfo復(fù)合物；

S5.將Biotin-Drug-ADA-Drug-Sulfo復(fù)合物加至MSD板上孵育；