[發(fā)明專利]一種基于磁微粒時間分辨熒光免疫分析法的胰石蛋白檢測方法

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• 申請日: 2022-06-06
• 公開（公告）號: CN115078708A
• 公開（公告）日: 2022-09-20
• 發(fā)明（設計）人: 項忠誼;黃飚;王璐;周秀梅;秦源;趙雪琴;王毅剛
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學
• 主分類號: G01N33/543
• 分類號: G01N33/543;G01N33/58;G01N33/533;G01N33/68
• 代理公司: 浙江納祺律師事務所 33257
• 代理人: 鄭滿玉;王士祥

本發(fā)明公開的是一種基于磁微粒時間分辨熒光免疫分析法的胰石蛋白檢測方法，屬于免疫檢測分析技術和納米生物技術領域檢測方法包括包被PSP抗體的磁微粒的制備，銪標記的PSP抗體的制備，將待測樣本、銪標記抗體、抗體偶聯(lián)的磁微粒混合孵育，反應后在磁力作用下洗滌，除去未結合物，之后加入增強液對銪進行解離增強，采用時間分辨熒光分析儀測定熒光值，本發(fā)明可以快速檢測待測樣本中PSP的含量，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等特點，可用于臨床對膿毒癥的輔助診斷，具有較好的應用前景。

技術領域

本發(fā)明涉及一種檢測方法，更具體一點說，涉及一種基于磁微粒時間分辨熒光免疫分析法的胰石蛋白檢測方法，屬于生物技術檢測領域。

背景技術

胰石蛋白(PSP)，也叫再生蛋白(Reg1α)，是一種由胰腺尖細胞分泌的C型凝集素蛋白。PSP最初用于確定胰腺損傷的嚴重程度。近年來，PSP主要在膿毒癥中被報道。以前的研究表明，PSP不僅在診斷敗血癥前3天急劇增加，而且可以決定膿毒癥的嚴重程度，預測嚴重患者的死亡率。因此，如何實現(xiàn)快速準確地檢測人血清中的PSP含量的方法具有重要的意義。

發(fā)明內(nèi)容

為了解決上述現(xiàn)有技術問題，本發(fā)明提供具有可以快速檢測待測樣本中PSP的含量，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等技術特點的一種基于磁微粒時間分辨熒光免疫分析法的胰石蛋白檢測方法。

為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)的：

一種基于磁微粒時間分辨熒光免疫分析法的胰石蛋白檢測方法，將PSP包被抗體包被在磁珠表面，形成免疫磁珠-抗體復合物，其中，0.1mg抗體包被10mg磁珠，抗體與磁珠的孵育條件為室溫避光旋轉16h；

對磁珠進行洗滌和分離，去除未結合的抗體；

將銪標記到PSP檢測抗體，并對抗體的使用量進行優(yōu)化以確定適合的抗體使用劑量，用分析緩沖液進行稀釋，避免檢測抗體過量；

將優(yōu)化劑量的磁珠，銪標檢測抗體和待測樣品，孵育條件為37℃震蕩12min，最終形成磁珠-PSP包被抗體-PSP抗原-銪標PSP檢測抗體熒光免疫復合物，經(jīng)時間分辨儀進行熒光檢測分析。

優(yōu)選的，免疫磁珠具有羧基修飾的功能基團，羧基修飾的功能基團的活化條件為：分別配置N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)，每10mg磁珠加入10mg/mL的N-羥基琥珀酰亞胺(NHS)和10mg/mL的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺(EDC)各28μL和40μL，并在室溫避光旋轉反應30min。

優(yōu)選的，利用離心管和磁力架對磁珠進行洗滌和分離。

優(yōu)選的，利用酶標板和96孔板磁力架對磁珠進行洗滌和分離。

優(yōu)選的，采用異硫氰酸芐基二亞乙基三胺四乙酸銪(DTTA-Eu)為雙功能螯合試劑，其一端螯合銪，另一端可與抗體的NH₂連接，每1mg抗體連接0.2mg銪螯合物。

優(yōu)選的，磁珠-PSP包被抗體-PSP抗原-銪標PSP檢測抗體熒光免疫復合物以銪作為熒光示蹤物，加入增強液使銪解離，再根據(jù)其熒光強度計算待測物含量。

優(yōu)選的，通過識別利用時間分辨熒光測量法和光譜分離技術排除樣品中非特異性干擾，測定最后產(chǎn)物中的熒光強度，實現(xiàn)有效地提高了檢測的靈敏度。

有益效果：本發(fā)明可以快速檢測待測樣本中PSP的含量，具有特異性強、靈敏度高、重復性好等特點，能夠用于臨床對膿毒癥的檢測，具有較好的應用前景。

附圖說明

圖1PSP檢測標準曲線。

具體實施方式

以下結合說明書附圖，對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不局限于以下實施例。