[發明專利]一種用于亞精胺合成的基因及高產亞精胺菌株的構建

有效

• 申請號: 202210629535.X
• 申請日: 2022-06-01
• 公開（公告）號: CN114874962B
• 公開（公告）日: 2023-10-24
• 發明（設計）人: 張山;丁利平
• 申請（專利權）人: 深圳中科欣揚生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/60;C12N15/54;C12N15/31;C12P13/00;C12R1/19
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 仇鈺瑩

本發明公開了一種用于亞精胺合成的基因及高產亞精胺菌株的構建，屬于生物技術領域。本發明在大腸桿菌中表達了來源于里氏木霉的甲硫氨酸脫羧酶基因speD，并在大腸桿菌中過表達內源的speE、speF和metK，敲除亞精胺代謝途徑中的亞精胺乙酰轉移酶speG和亞精胺吸收轉運體PotD，異源表達來源于鮑曼不動桿菌中負責多胺類物質外泌的蛋白AmvA，構建得到了能夠高效合成亞精胺的重組大腸桿菌BWΔGΔD?DEFK?A。重組大腸桿菌BWΔGΔD?DEFK?A在搖瓶和發酵罐體系中亞精胺的產量分別可達347mg/L和2.11g/L，單位菌體的亞精胺合成量分別為115.7mg/gDCW和132.7mg/gDCW。亞精胺合成量在現有的亞精胺生物合成領域占有領先優勢、具備廣闊的應用前景。

技術領域

本發明涉及一種用于亞精胺合成的基因及高產亞精胺菌株的構建，屬于生物技術領域。

背景技術

亞精胺(三鹽酸亞精胺，C₇H₁₉N₃,Spermidine)是含有3個氨基的低分子量脂肪族含氮堿，是存在于所有生物體中的天然多胺之一。亞精胺普遍存在于動植物以及微生物細胞中，它是一類帶正電的烷基胺類聚合陽離子，極易與帶負電的分子——DNA、RNA、蛋白質和脂質等結合。研究表明，亞精胺的大部分生物學功能是通過與DNA、RNA和蛋白質等帶負電的生物分子的靜電反應來完成的。由于亞精胺對核酸高的親和力，它能中和磷酸主鏈中一部分負電荷從而穩定DNA和RNA，并且亞精胺還參與細胞生長、增殖和死亡等重要的生命過程。另外，研究發現亞精胺能有效激活細胞的自噬作用，再次證明亞精胺對細胞衰老具有重要調控作用和功能。臨床研究表面，亞精胺能保護心血管疾病，預防癌癥和消炎。亞精胺作為一種無毒的天然物質，功能強大，將其作為一種新型預防和抗衰老的藥劑具有相當大的潛力。目前已有亞精胺的膳食補充劑投放市場，但是通過從小麥胚芽中化學提取得到，過程復雜并且產量低，所以如何大量生產安全天然的亞精胺成為亟待解決的問題。

目前有關亞精胺生物合成的研究很少，南京工業大學利用大腸桿菌表達亞精胺合成所需的酶并采用酶液催化的方法得到亞精胺，亞精胺產量為3.7g/L，但由于底物SAM價格昂貴，不適合大規模生產(Atwo-enzyme cascade system for the bio-production ofspermidine from putrescine，公開于2021年)。所以在大腸桿菌中實現亞精胺高效生物合成并實現其外泌是亟待解決的問題。亞精胺在大腸桿菌中存在兩條合成途徑(如圖1)，分別是鳥氨酸途徑和精氨酸途徑，前者鳥氨酸在鳥氨酸脫羧酶(Ornithine Decarboxylase,ODC)作用下生成腐胺，后者精氨酸在精氨酸脫羧酶(Arginine Decarboxylase,ADC)作用下生成胍丁胺(Agmatine)，進而生成腐胺，腐胺在亞精胺合成酶(Spermidine Synthase)作用下接受S-腺苷甲硫氨酸(S-Adenosyl Methionine,SAM)在S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(S-Adenosylmethionine Decarboxylase)作用下生成的氨丙基從而得到亞精胺。亞精胺合成途徑的實現涉及幾個關鍵酶基因：鳥氨酸脫羧酶基因(speF)、亞精胺合成酶基因(speE)、S-腺苷甲硫氨酸合成酶(metK)、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶(speD)。雖然亞精胺的合成途徑是比較明晰的，但目前仍然缺少高效的酶、使得生物法生產亞精胺的效率還不高。

發明內容

本發明選擇大腸桿菌為表達代謝宿主，通過表達亞精胺合成通路的關鍵基因，阻斷亞精胺的降解的同時增強亞精胺的外泌，實現高效合成，滿足市場對于亞精胺的需求。