[發(fā)明專利]一種基于靶控選擇雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測(cè)雙真菌毒素的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210627285.6
• 申請(qǐng)日: 2022-06-06
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN115058506B
• 公開(kāi)（公告）日: 2023-04-07
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 楊黎
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 綿陽(yáng)市第三人民醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12Q1/6876
• 分類號(hào): C12Q1/6876;C12Q1/6816;C12N15/115
• 代理公司: 南京中律知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 32341
• 代理人: 沈振濤

一種基于靶控選擇雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測(cè)雙真菌毒素的方法。本發(fā)明提供了一種用于多種真菌毒素?zé)晒鈾z測(cè)的靶控選擇雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。赭曲霉毒素A(OTA)和黃曲霉毒素B1(AFB1)可以與金納米粒子上的特定適配子結(jié)合，導(dǎo)致短DNA觸發(fā)序列的釋放。短DNA觸發(fā)序列可以觸發(fā)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的不同反應(yīng)路線，從而產(chǎn)生兩種側(cè)鏈序列。側(cè)鏈序列可以導(dǎo)致DNA鑷子打開(kāi)，從而恢復(fù)熒光信號(hào)。赭曲霉毒素A的線性檢測(cè)范圍為0.06至2ng/mL,Rsupgt;2/supgt;＝0.994，黃曲霉毒素B1的線性檢測(cè)范圍為0.005至1ng/mL,Rsupgt;2/supgt;＝0.992，赭曲霉毒素A的檢測(cè)限為0.02ng/mL，黃曲霉毒素B1的檢測(cè)限為0.002ng/mL。更重要的是，它在實(shí)際食品樣品分析中顯示出極高的靈敏度和選擇性，可同時(shí)檢測(cè)赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種雙真菌毒素的檢測(cè)領(lǐng)域，特別是基于靶控選擇雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和熒光的雙真菌毒素檢測(cè)方法領(lǐng)域。

背景技術(shù)

幾種慢性病與接觸污染食品中的一種或多種真菌毒素有關(guān)，包括胃腸道或腎臟疾病，以及免疫抑制。此外，一些真菌毒素已被國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)列為致癌物。一些調(diào)查表明，聯(lián)合攝入真菌毒素可能比僅攝入其中一種真菌毒素會(huì)導(dǎo)致更高的毒性和損害。例如，大多數(shù)與赭曲霉毒素A的真菌毒素混合物表現(xiàn)出加性或協(xié)同效應(yīng)，表明這些組合可能會(huì)產(chǎn)生更強(qiáng)的毒性效應(yīng)。在過(guò)去幾年中，多種真菌毒素對(duì)健康的威脅引起了人們對(duì)不同毒素共存及其協(xié)同毒性效應(yīng)的擔(dān)憂。已經(jīng)做出了許多努力來(lái)開(kāi)發(fā)檢測(cè)食品和飼料中真菌毒素的分析方法，包括酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、高效液相色譜(HPLC)和液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(LC/MS)、電化學(xué)、比色法。盡管傳統(tǒng)技術(shù)提供了高靈敏度、準(zhǔn)確性和效率。由于不同種類毒素的化學(xué)多樣性，這阻礙了LC/MS等技術(shù)的選擇性和多分析物能力，因此檢測(cè)多種真菌毒素仍然是一個(gè)巨大的挑戰(zhàn)。

發(fā)明內(nèi)容

適配子是單鏈DNA或RNA寡核苷酸，在生物學(xué)領(lǐng)域是一種可靠且有前途的靶向劑。核酸適配子因其對(duì)靶標(biāo)的特殊結(jié)合親和力和特異性而被視為化學(xué)或核酸抗體。此外，適配子與蛋白質(zhì)抗體相比還顯示出一些優(yōu)勢(shì)，包括高穩(wěn)定性、易于化學(xué)合成、低成本、適應(yīng)性修飾、低免疫原性和大的組織滲透性。因此，適配子被認(rèn)為是重金屬、小分子、肽和蛋白質(zhì)生物傳感的一個(gè)有希望的候選物。為了提高基于適配子的策略的靈敏度，雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)因其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，如無(wú)酶和等溫條件而備受關(guān)注。它還與各種信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制耦合：比色法、熒光、電化學(xué)和電化學(xué)發(fā)光。DNA鑷子是一種鑷子形狀的納米器件，由DNA序列通過(guò)Watson-Crick堿基配對(duì)編程和構(gòu)建。它可以執(zhí)行納米級(jí)的運(yùn)動(dòng)，以控制響應(yīng)調(diào)節(jié)器的“開(kāi)”和“關(guān)”。DNA鑷子也可以通過(guò)一起構(gòu)建多個(gè)DNA鑷子來(lái)用于多個(gè)分析物篩選。

熒光檢測(cè)策略因其良好的水溶性而引起了極大的研究興趣，并在許多應(yīng)用中具有巨大的潛力，信號(hào)轉(zhuǎn)換效率高，生物相容性好，實(shí)時(shí)檢測(cè)。它還可以通過(guò)與適配子結(jié)合來(lái)檢測(cè)各種真菌毒素。

為解決現(xiàn)有技術(shù)的問(wèn)題，本發(fā)明提供一種靶控選擇雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，用于多種真菌毒素?zé)晒鈾z測(cè)。在金納米顆粒上修飾了兩種真菌毒素適配子。在相應(yīng)的靶點(diǎn)存在下，適配子可以與其靶點(diǎn)結(jié)合并釋放一個(gè)短DNA觸發(fā)序列。短DNA觸發(fā)序列可以與其他發(fā)夾雜交并誘導(dǎo)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)。通過(guò)選擇雜交可以形成一個(gè)長(zhǎng)的雙鏈，使兩個(gè)發(fā)夾的尾部靠近，從而產(chǎn)生一個(gè)完整的側(cè)鏈DNA。側(cè)鏈DNA的序列取決于雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的不同反應(yīng)路線，而雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)受特定靶點(diǎn)控制。此外，側(cè)鏈DNA與DNA鑷子的鎖定序列互補(bǔ)。因此，它可以打開(kāi)DNA鑷子，使熒光信號(hào)顯著恢復(fù)。赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1的濃度可以通過(guò)相應(yīng)的熒光強(qiáng)度進(jìn)行定量測(cè)定。此外，它可以提供高靈敏度和高選擇性的同時(shí)檢測(cè)雙真菌毒素的真實(shí)食品樣品。

具體來(lái)講，本發(fā)明是一種基于靶控選擇雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的同時(shí)檢測(cè)赭曲霉毒素A(OTA)和黃曲霉毒素B1(AFB1)的方法，包括如下步驟：

1)合成金納米顆粒；