[發明專利]一種基于靶控選擇雜交鏈式反應的檢測雙真菌毒素的方法

有效

• 申請號: 202210627285.6
• 申請日: 2022-06-06
• 公開（公告）號: CN115058506B
• 公開（公告）日: 2023-04-07
• 發明（設計）人: 楊黎
• 申請（專利權）人: 綿陽市第三人民醫院
• 主分類號: C12Q1/6876
• 分類號: C12Q1/6876;C12Q1/6816;C12N15/115
• 代理公司: 南京中律知識產權代理事務所(普通合伙) 32341
• 代理人: 沈振濤

1.一種基于靶控選擇雜交鏈式反應的同時檢測赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1的方法，包括如下步驟：

1)合成金納米顆粒；

2)在10mM的pH?7.5的PBS溶液中，將巰基修飾的赭曲霉毒素A適配子、巰基修飾的黃曲霉毒素B1適配子、赭曲霉毒素A短觸發DNA序列和黃曲霉毒素B1短觸發DNA序列雜交；

其中，巰基修飾的赭曲霉毒素A適配子序列為GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAAAGTGG-HS；黃曲霉毒素B1適配子序列為GTTGGGCACGTGTTGTCTCTCTGTGTCTCGTGCCCTTCGCTAGGCCCACTTTGTA-HS；赭曲霉毒素A短觸發DNA序列為AGGCCCACTTTGTCCGAT，黃曲霉毒素B1短觸發DNA序列GTCGTACAAAGTGGGCCT；

3)將步驟1)所得的金納米顆粒與步驟2)所得的雜交適配子一起孵育過夜，以Au-s鍵修飾金納米顆粒上的適配子，再以12000rpm的轉速離心金納米顆粒，并將其重新分散在10mM的pH?7.5的PBS溶液中；

4)DNA鑷子的形成：將用于形成DNA鑷子的序列1-6混合孵育，以形成DNA鑷子，其中用于形成DNA鑷子的序列1-6依次分別為：帶有Cy5熒光基團的Cy5-GG-TTTATA-T-C-ACCGTA-TA-BQH3,其中，BHQ3是熒光基團Cy5的熒光淬滅劑；帶有FAM熒光基團的FAM-AA-TGGCCT-A-C-AATATT-CG-DABCYL，其中DABCYL是熒光基團FAM的熒光淬滅劑；AATATT-TAGGACTCAGATGTTT-CCCC-GGTAGTATCTATCCTG-TATAAA；TACGGT-GATT?ACAGCGAGGTTG-CCCC-GGATCACTACACAGTA-AGGCCA；CAGGATAGATACTACC-AA-CAACCTCGCTGTAATC；TACTGTGTAGTGATCC-AT-AAACATCTGAGTCCTA；

5)將待檢測液與步驟3)所得產物混合在室溫下孵育30分鐘后，將溶液以12000rpm的轉速離心15分鐘，取上清液為產物；

6)將步驟5)所得產物與選擇發卡、發卡1和發卡2混合孵育，其中選擇發卡序列ATCGGA-CAAAGTGGGCCT-CAAAGT-AGGCCCACTTTG-TACGAC，發卡1序列為TATACGGTG

-AGGCCCACTTTG-TCCGAT-CAAAGTGGGCCT-ACTTTG-ATATAAACC，發卡2序列為CGAATATTG

-ACTTTG-AGGCCCACTTTG-GTCGTA-CAAAGTGGGCCT-TAGGCCATT；

7)將步驟6)所得產物與步驟4)所得DNA鑷子混合孵育；

8)檢測步驟7)所得產物的熒光信號，用標準曲線法對赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1進行定量。

2.根據權利要求1所述方法，其特征在于，步驟4)中，用于形成DNA鑷子的序列1-6混合孵育后將混合物加熱至90℃并緩慢冷卻以形成DNA鑷子。

3.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于，步驟6)具體為：將100μL步驟5)所得上清液與150nm選擇發夾、50nm發卡1和50nm發卡2孵育90min。

4.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于，步驟7)具體為：將步驟6)所得產物與200nm步驟4)所得DNA鑷子混合孵育半小時。

5.根據權利要求1或2所述方法，其特征在于，上述步驟8)具體為：使用熒光計記錄熒光基團FAM和Cy5的熒光信號，其中熒光基團FAM的激發波長為486nm，發射波長為500nm至600nm，熒光基團Cy5的激發波長為640nm，發射波長為650nm至750nm，然后，通過熒光強度-濃度標準曲線對赭曲霉毒素A和黃曲霉毒素B1進行定量。