[發明專利]基于ilvC突變體高產D-泛酸的基因工程菌、構建方法及應用

在審

• 申請號: 202210625163.3
• 申請日: 2022-06-02
• 公開（公告）號: CN115109737A
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 張博;劉平;金潔漪;楊玉鳳;柳志強;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

本發明涉及一種基于ilvC突變體高產D?泛酸的基因工程菌及其構建方法，以及該基因工程菌在微生物發酵制備D?泛酸中的應用。運用代謝工程改造、酶改造、代謝通量的優化等方式，構建了一株性能更優的D?泛酸生產菌株，在提高酶對底物2?酮泛解酸的親和力同時，促進了前體D?泛解酸的合成，并且相對于出發菌株，L?纈氨酸的積累量基本沒變，最終使D?泛酸的效價從4.72g/L提高至5.30g/L。

(一)技術領域

本發明涉及一種基于ilvC突變體高產D-泛酸的基因工程菌及其構建方法，以及該基因工程菌在微生物發酵制備D-泛酸中的應用。

(二)背景技術

泛酸，也稱為維生素B5，是輔酶A的組成成分之一，在能量代謝以及檸檬酸循環等重要生化反應中起到關鍵作用。因此，作為一種重要的維生素及前體物質，D-泛酸在飼料、醫藥以及化妝品等方面得到廣泛應用。在已知的D-泛酸合成方法中，生物發酵法生產D-泛酸具有底物廉價、易分離、毒性小等優勢而受到關注。但目前利用生物法生產D-泛酸仍存在缺陷，例如發酵過程不穩定、產量不高等問題。因此，構建一株更高產的D-泛酸菌株仍是一大挑戰。

(三)發明內容

本發明的目的是提供一種基于ilvC突變體高產D-泛酸的基因工程菌構建方法，以及該基因工程菌在微生物發酵制備D-泛酸中的應用。

本發明采用的技術方案是：

一種基于ilvC突變體高產D-泛酸的基因工程菌，由如下方法構建：運用基因編輯技術，對ilvC基因413號密碼子進行定點突變，將異亮氨酸突變為丙氨酸，并通過中高拷貝質粒pTrc99a使其在底盤菌DPAN15(E.coli W3110 Trc-panC/Trc-panE/Trc-panB/Trc-ilvC/ilvG^*/ΔavtA/ilvE^*/coaA/△poxB/△pta/△ldhA△plfB/ Trc-pykA/ilvN*/ilvH*/Trc-spoT*/Trc-lpd/Trc-ilvD/△lacI^*，已在CN 113278569 A中公開) 中過表達，得到DPAN15/pTrc99a-ilvC^I413A，即所述基于ilvC突變體高產D-泛酸的基因工程菌。

本發明在前期實驗室已構建的無質粒、無誘導劑使用的D-泛酸生產菌株 DPAN15的基礎上，運用代謝工程改造、酶改造、代謝通量的優化等方式，構建了一株性能更優的D-泛酸生產菌株。本發明菌株的構建方法具體如下：通過改造底物與酮醇酸還原異構酶相互作用附近位點，改變其底物混雜性，為了得到酶分子與底物2-酮泛解酸相互作用的構象，采用Autodock軟件對其進行對接，其中酮醇酸還原異構酶AHAIR的晶體結構(PDB ID：3ULK)由PDB蛋白質結構數據庫(Protein Data Bank)中獲得，從對接結果來看(圖1)，酶分子的活性口袋較淺，底物更易結合在酶上，這也解釋了為什么AHAIR能催化多種2-酮酸進行反應。

本發明從底物與酶結合的復合物0.5nm附近位置隨機選擇了9個預測位點，這些位點均位于酮醇酸還原異構酶的活性口袋和底物相互作用的位點附近，將9 個位點均突變為丙氨酸后，隨后對其分別進行搖瓶發酵，作為最優選的方案，最終使搖瓶中D-泛酸產量從4.72g/L提升至5.30g/L，并且相對于出發菌株，所得發酵液中L-Valine的含量基本沒變，維持在1.1g/L左右。

本發明運用分子對接，對酮醇酸還原異構酶AHAIR進行定點突變，通過增強底物與酶的結合能力，提高了2-酮泛解酸對底物的親和能力，最終得到突變質粒trc-ilvCI413A，在加強D-泛解酸途徑的同時，未影響L-纈氨酸的合成。最后通過搖瓶發酵，使D-泛酸產量從4.72g/L提升至5.30g/L，且相對于出發菌株，所得發酵液中L-Valine的含量基本沒變，維持在1.1g/L左右。

本發明還涉及構建所述基因工程菌的方法，所述方法包括：