[發明專利]基于ilvC突變體高產D-泛酸的基因工程菌、構建方法及應用

在審

• 申請號: 202210625163.3
• 申請日: 2022-06-02
• 公開（公告）號: CN115109737A
• 公開（公告）日: 2022-09-27
• 發明（設計）人: 張博;劉平;金潔漪;楊玉鳳;柳志強;鄭裕國
• 申請（專利權）人: 浙江工業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/53;C12N15/70;C12P13/02;C12R1/19
• 代理公司: 浙江千克知識產權代理有限公司 33246
• 代理人: 冷紅梅

1.一種基于ilvC突變體高產D-泛酸的基因工程菌，由如下方法構建：運用基因編輯技術，對ilvC基因413號密碼子進行定點突變，將異亮氨酸突變為丙氨酸，并通過中高拷貝質粒pTrc99a使其在底盤菌DPAN15中過表達，得到DPAN15/pTrc99a-ilvC^I413A，即所述基于ilvC突變體高產D-泛酸的基因工程菌。

2.構建權利要求1所述基因工程菌的方法，所述方法包括：

(1)運用基因編輯技術，對ilvC基因413號密碼子進行定點突變，將異亮氨酸突變為丙氨酸，得到運用基因編輯技術，得到ilvC^I413A；

(2)運用基因編輯技術，通過中高拷貝質粒pTrc99a使ilvC^I413A在底盤菌DPAN15中過表達，得到DPAN15/pTrc99a-ilvC^I413A，即所述基于ilvC突變體高產D-泛酸的基因工程菌。

3.權利要求1所述基因工程菌在微生物發酵制備D-泛酸中的應用。

4.如權利要求3所述的應用，其特征在于所述應用為：將所述基因工程菌菌株接種至含有Kan抗性的發酵培養基中，25～30℃、100～200rpm條件下進行發酵培養至OD600＝0.8～1.0時，添加終濃度為0.2mM的IPTG，之后轉至30℃，180rpm下繼續培養48h，發酵結束后取發酵液上清分離純化得到D-泛酸。

5.如權利要求4所述的應用，其特征在于所述發酵培養基組成如下：葡萄糖24g/L、(NH₄)₂SO₄ 12g/L、KH₂PO₄ 1g/L、MgSO₄ 0.5g/L、酵母提取物2g/L、CaCO₃10g/L，1ml/L微量元素溶液，溶劑為去離子水，pH值自然；微量元素溶液組成為：10g/L CuCl₂、10g/L FeSO₄·7H₂O、1g/L ZnSO₄·7H₂O、0.20g/L CuSO₄、0.02g/L NiCl₂·7H₂O，溶劑為去離子水。

6.如權利要求5所述的應用，其特征在于所述基因工程菌發酵前，先接種至LB培養基中，于37℃、200rpm的搖床上過夜培養，之后以體積濃度2％接種量接種到發酵培養基中進行發酵培養。