[發明專利]一種檢測產志賀毒素大腸埃希氏菌的CPA引物組合及方法

在審

• 申請號: 202210625095.0
• 申請日: 2022-06-02
• 公開（公告）號: CN114908179A
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 王鳴秋;余祝君;劉艷;余軍偉;彭青枝;周艷瓊;周陶鴻;張莉;范志勇;李詩瑤;王遵浩;周倩;臧偉慶;尤其敏;林藝志
• 申請（專利權）人: 湖北省食品質量安全監督檢驗研究院;杭州優思達生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6858;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 深圳峰誠志合知識產權代理有限公司 44525
• 代理人: 張騰

本發明公開了一種檢測產志賀毒素大腸埃希氏菌的交叉引物核酸恒溫擴增引物組合和方法。該引物組合用于檢測stx1a、stx1c、stx1d、stx2a、stx2b、stx2c、stx2d、stx2e、stx2f和stx2g共10種基因亞型，包含核苷酸序列為SEQ ID NO:1～5的引物組I，SEQ ID NO:6～10的引物組II,SEQ ID NO:11～20的引物組III。本發明提供的方法操作簡單，特異性好、靈敏度高，可在50min內完成核酸檢測，為監管部門對重大活動保障和突發應急事件中食品致病菌檢測提供快速的篩查結果。同時，本發明首次設計篩選引物組合實現STEC全部基因亞型的檢測，結合核酸檢測試紙條及一體化檢測裝置可實現全過程無儀器依賴及可視化結果判斷，極大滿足了現場檢測的需求。

技術領域

本發明屬于生物技術檢測領域，特別涉及一種檢測產志賀毒素大腸埃希氏菌的CPA引物組合、試劑盒及方法。

背景技術

產志賀毒素大腸桿菌(Shiga toxin-producing Escherichia coli，STEC)是近年來出現的一群重要的食源性致病菌，在多國引發人的感染和流行。盡管O157∶H7是STEC典型的血清型，但是近年來非O157 STEC感染病例全球性的增加也預警了研究調查非O157 STEC的重要性。STEC可導致患者出現腹瀉、出血性結腸炎，其中有2％～7％的病人出現血栓性血小板減少性紫癜及溶血性尿毒綜合征，嚴重者甚至死亡，所以STEC引起的食源性疾病已成為嚴重的公共衛生安全問題。嚴重威脅著人們的健康。因此,快速、準確的檢測STEC是有效預防和控制感染的前提條件。

目前,檢測STEC的主要分子靶點是編碼志賀毒素的stx基因，國家標準化組織和美國農業部均采用實時熒光定量PCR對食品中STEC進行初篩。但熒光定量PCR必須依賴昂貴的精密儀器，檢測費用較高，對檢測人員也有較高的技術要求，無法滿足現場檢測的需求。交叉引物擴增法(Crossing-primer amplification,CPA)是我國唯一獨立知識產權的恒溫擴增技術，可以在恒溫條件下快速、特異、靈敏地擴增目標序列，并且不需要昂貴的檢測設備，大大降低了檢測費用的同時，可以直接應用于食品安全現場保障和應急檢測。另一方面，相比于其他恒溫擴增技術，交叉引物擴增通過對檢測引物進行標記，在擴增完成后直接膠體金層析進行可視化觀察結果，更適合于現場檢測。

stx基因亞型的突變和重組現象較為普遍，現有報道的基因型主要有10種，其中stx1基因亞型3種，分別是stx1a，stx1c，stx1d；stx2基因亞型7種，分別為stx2a，stx2b，stx2c，stx2d，stx2e，stx2g，stx2f。不同基因亞型之間核苷酸序列差異較大，很難用一種通用引物同時擴增所有亞型。如攜帶stx1a的STEC可引起HUS，但攜帶stx1c的菌株僅能引起輕微腹瀉，或者沒有明顯的癥狀，攜帶stx2a，stx2c，stx2d的STEC均可引起嚴重的臨床癥狀，而攜帶stx2b，stx2e，stx2f的STEC較為溫和，不會引發嚴重的臨床癥狀。食品中低于100CFU的STEC菌體就可能導致人類患病，STEC共有超400種血清型，在非O157:H7血清型的產志賀毒素大腸埃希菌(Non-O157 STEC)中，有6種被認為是檢出率最高、危害較大的菌株，分別是O26(22％)、O111(16％)、O103(12％)、O121(8％)、O45(7％)和O145(5％)。美國疾控中心發布的數據顯示，2016年美國有5 441例經確認的STEC感染事件，預估有超過26萬名患者，導致30人死亡。國際上主要采用實時聚合酶鏈式反應(real-time polymerase chainreaction，real-time PCR)對其進行檢測，其中使用較廣的國際標準化組織(International Organization for Standardization，ISO)和美國農業部(UnitedStates Department of Agriculture，USDA)方法也采用該技術對疑似含STEC的增菌培養物進行初篩。然而，real-time PCR方法需要溫度在50～100℃間不停變化，對相關檢測設備要求較高，無法便攜攜帶，較難滿足基層實驗室和現場快速檢測的需求。

發明內容