[發明專利]一種檢測產志賀毒素大腸埃希氏菌的CPA引物組合及方法

在審

• 申請號: 202210625095.0
• 申請日: 2022-06-02
• 公開（公告）號: CN114908179A
• 公開（公告）日: 2022-08-16
• 發明（設計）人: 王鳴秋;余祝君;劉艷;余軍偉;彭青枝;周艷瓊;周陶鴻;張莉;范志勇;李詩瑤;王遵浩;周倩;臧偉慶;尤其敏;林藝志
• 申請（專利權）人: 湖北省食品質量安全監督檢驗研究院;杭州優思達生物技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6858;C12N15/11;C12R1/19
• 代理公司: 深圳峰誠志合知識產權代理有限公司 44525
• 代理人: 張騰

1.一種檢測產志賀毒素大腸埃希氏菌的CPA引物組合，由引物組II或引物組III組成，

引物組II，用于檢測待測物是否含stx1亞型STEC，包括：

剝離引物stx1-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

剝離引物stx1-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

交叉引物stx1-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

檢測引物stx1-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

檢測引物stx1-5的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

引物組III，用于檢測待測物是否含stx2亞型STEC，包括：

剝離引物stx2-1的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

剝離引物stx2-2的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

剝離引物stx2-3的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

剝離引物stx2-4的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

交叉引物stx2-5的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示；

交叉引物stx2-6的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；

檢測引物stx2-7的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示；

檢測引物stx2-8的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示；

檢測引物stx2-9的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

檢測引物stx2-10的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

檢測引物stx1-4/stx2-7/stx2-8的5'末端標記有異硫氰酸熒光素基團，檢測引物stx1-5/stx2-9/stx2-10的5'端標記有生物素熒光基團。

2.含權利要求1所述的CPA引物組合的試劑，其特征在于：

含引物組II的CPA反應體系如下：

成分保存濃度加樣量

Bst酶5U/μL 1～3μL

Bst酶緩沖液10X 2.5μL

剝離引物stx1-1為SEQ ID NO.6：10μmol/L 0.5～1.5～μL

剝離引物stx1-2為SEQ ID NO.7：10μmol/L 0.5～1.5μL

交叉引物stx1-3為SEQ ID NO.8：10μmol/L 2.0～4.0μL

檢測引物stx1-4為SEQ ID NO.9：10μmol/L 1.25～3.25μL

檢測引物stx1-5為SEQ ID NO.10：10μmol/L 1.25～3.25μL

DNA樣品5μL

雙蒸水補足體積至25μL

總體積25μL

含引物組III的CPA反應體系如下：

成分保存濃度加樣量

Bst酶5U/μL1～3μL

Bst酶緩沖液10X 2.5μL

剝離引物stx2-1為SEQ ID NO.11：10μmol/L 0.5～1.5～μL

剝離引物stx2-2為SEQ ID NO.12：10μmol/L 0.5～1.5μL

剝離引物stx2-3為SEQ ID NO.13：10μmol/L 0.5～1.5μL

剝離引物stx2-4為SEQ ID NO.14：10μmol/L 0.5～1.5μL

交叉引物stx2-5為SEQ ID NO.15：10μmol/L 2.0～4.0μL

交叉引物stx2-6為SEQ ID NO.16：10μmol/L 2.0～4.0μL

檢測引物stx2-7為SEQ ID NO.17：10μmol/L 1.25～3.25μL

檢測引物stx2-8為SEQ ID NO.18：10μmol/L 1.25～3.25μL

檢測引物stx2-9為SEQ ID NO.19：10μmol/L 1.25～3.25μL

檢測引物stx2-10為SEQ ID NO.20：10μmol/L 1.25～3.25μL

DNA樣品5μL

雙蒸水補足體積至25μL

總體積25μL

其中Bst酶緩沖液的成分為200～500mM Tris-HCl、100～300mM (NH₄)₂SO₄、100～300mMKCl、20mM MgSO₄、質量百分比1％～5％Triton X-100，25℃環境下，pH值為8.0～8.8。