[發明專利]一種赭鹿花菌分子身份證及其擴增引物、檢測試劑盒和物種鑒定方法

在審

• 申請號: 202210623852.0
• 申請日: 2022-06-02
• 公開（公告）號: CN114774580A
• 公開（公告）日: 2022-07-22
• 發明（設計）人: 田恩靜;謝曉梅;段仁和;曹廣乘
• 申請（專利權）人: 吉林農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04;C12N15/11
• 代理公司: 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司 11385
• 代理人: 戴嵩瑋

本發明提供了一種赭鹿花菌分子身份證及其擴增引物、檢測試劑盒和物種鑒定方法，屬于物種鑒定技術領域。本發明基于DNAmini?barcode技術開發出一種赭鹿花菌分子身份證，可有效鑒定赭鹿花菌物種，并且具有超高的檢測靈敏度。本發明還基于赭鹿花菌分子身份證設計得到一對特異性引物，利用所述引物進行檢測，可大大的降低了誤食赭鹿花菌的檢測時間和成本，且操作便利。可見本發明提供鑒定方法為蘑菇中毒事件的現場快速實時檢測提供了基礎，同時進一步完善了蘑菇產品質量與安全的監督檢測體系。

技術領域

本發明屬于物種鑒定技術領域，具體涉及一種赭鹿花菌分子身份證及其擴增引物、檢測試劑盒和物種鑒定方法。

背景技術

赭鹿花菌(Gyromitra infula(Schaeff.)Quél.)是一種易被誤食的有毒蘑菇，在我國不同地區夏秋季均有分布，與可食用的馬鞍菌(粗柄馬鞍菌Helvella macropus(Pers.)P.Karst.)極為相似，易與其混淆發生誤食中毒。它含有鹿花菌素和水解產物甲基聯胺，可溶解和破壞紅細胞，進而引起急性溶血。赭鹿花菌中毒事件一旦發生，快速檢測和鑒定赭鹿花菌對于蘑菇中毒事件的調查、中毒患者的救助就會顯得尤為重要和迫切(李海蛟等，2020)。

蘑菇中毒在臨床治療和法醫學分析過程中，需要從剩余物、煮熟的蘑菇、嘔吐物或者胃提取物中取得樣本用于檢測。由于高溫、高壓和胃液的消化會引起DNA的降解和碎片化(Goldstein and Desalle,2003)。Meusnier等人發現COI序列中短于250bp的基因片段鑒定成功率在90％以上，因此提出使用“mini-barcode”的方法來解決處理過后的樣品DNA降解問題。隨后，越來越多的研究學者表明短于300bp的基因片段不會影響對降解的DNA的檢測反而比全長的基因序列更容易擴增。目前基于DNA mini-barcode技術，韓建萍課題組首次提出了中藥材分子身份證的概念。分子身份證指一段極短(20-50bp)且物種特異的DNA序列，該序列僅存在于目標物種的基因組中，用于鑒定混合DNA樣品中的某種特定樣品。由于分子身份證技術具有鑒定效率高、特異性強等特征，因此，非常適用于有毒蘑菇的鑒定及快速檢測。

然而分子身份證越段其攜帶的特異性的DNA分子信息越少，對成功準確鑒定物種越困難。目前尚未有關于準確表征赭鹿花菌的分子身份證的報道。

發明內容

有鑒于此，本發明的目的在于提供一種赭鹿花菌分子身份證及其擴增引物、檢測試劑盒和物種鑒定方法，可以快速準確地檢測中毒事件中的有毒蘑菇是否含有赭鹿花菌，為后續快速治療提供依據。

本發明提供了一種赭鹿花菌分子身份證，赭鹿花菌分子身份證的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示或與SEQ ID NO:1互補的序列。

本發明提供了一種特異性擴增所述赭鹿花菌分子身份證的引物，包括核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的反向引物。

本發明提供了一種鑒定赭鹿花菌的檢測試劑盒，包括所述引物和檢測試劑。

優選的，所述檢測試劑包括PCR擴增用試劑。

優選的，所述檢測試劑盒還包括陽性標準品；

所述陽性標準品為所述赭鹿花菌分子身份證。

本發明提供了一種赭鹿花菌的物種鑒定方法，包括以下步驟：

1)提取待檢測樣本的基因組DNA；

2)以步驟1)中所述基因組DNA為模板，用所述引物進行PCR擴增，得到PCR產物；

3)將所述PCR產物進行電泳和測序，得到122bp的序列判斷待檢測樣本為赭鹿花菌。