[發明專利]用于實施免疫組庫測序的組合物及試劑盒和測序方法

在審

• 申請號: 202210616324.2
• 申請日: 2022-05-31
• 公開（公告）號: CN114934096A
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發明（設計）人: 張天成;沈曉蓉;吳斌;施惠娟
• 申請（專利權）人: 上海市生物醫藥技術研究院
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 上海新隆知識產權代理事務所(普通合伙) 31366
• 代理人: 劉蘭英

一種用于實施免疫組庫測序的組合物，包括如SEQ ID NO:1所示逆轉錄引物，含有如SEQ ID NO:17所示序列的鏈置換引物，第一PCR引物對，用于裝在Tn5轉座酶的核酸：如SEQ ID NO:3所示接頭Tn?A和SEQ ID NO:4所示的嵌合端；以及第二PCR引物對。本發明的核酸組合物適用于以短讀長測序平臺對全長適應性免疫組庫進行測序，只需要構建一個文庫即可利用短讀長的測序數據組裝出完整的BCR和TCR全長序列，有效降低測序的成本，進一步提高測序的通量，提高測序效率。

技術領域

本發明涉及一種用于測序的核酸組合物，特別涉及一種適應性免疫組測序的核酸組合物，以及測序試劑盒，和以短讀長測序平臺對全長適應性免疫組庫進行測序的方法。

背景技術

適應性免疫是機體針對特異性抗原刺激產生的免疫應答。其存在使機體無需每時每刻都保持消耗巨大的免疫應激狀態。適應性免疫系統的多樣性，也保證生物體能應對自然環境中復雜且多變的風險。在此過程中，T淋巴細胞和B淋巴細胞及其表面分子T細胞受體(TCR)，B細胞受體(BCR，BCR的分泌形式即為抗體。)是機體執行適應性免疫的分子基礎。

檢測TCR和BCR序列的適應性免疫受體庫測序(Adaptive Immune ReceptorRepertoire sequencing,AIRR-seq)是研究免疫系統動力學的常用方法。目前已有眾多的適應性免疫受體庫測序方法被開發。適應性免疫組測序一般以免疫細胞中的RNA為建庫材料。但實際操作中，通常首選獲得的往往是外周血的全血。全血中含有大量的紅細胞和少量的免疫細胞，進行適應性免疫組測序之前需要先用密度梯度離心法先獲得免疫細胞。之后還需要從免疫細胞中提取RNA，才能開始進行建庫。整個操作較為復雜，且成本較高。

此外，包含完整信息的BCR和TCR全長序列超過了600bp，而目前主流的高通量測序主要是基于短讀長的測序方案。雙端測序PE150最多只能測通200bp～250bp的短DNA片段，而對于擴增出來的全長片段，如：孫濤等人通過5’RACE擴增BCR和TCR全長為600-700bp(CN107058484A)，只能檢測DNA片段兩端的序列，這樣無法獲得CDR3區域的完整信息。而若采用雙端測序PE300技術，不僅成本昂貴，而且通量較低。

發明內容

本發明的一個目的在于提供一種用于實施免疫組庫測序的組合物，降低現有測序方法的復雜性，提高便捷性。

本發明的另一個目的在于提供一種用于實施免疫組庫測序的組合物，有效降低測序的成本。

本發明的再一個目的在于提供一種用于實施免疫組庫測序的組合物，進一步提高測序的通量，提高測序效率。

本發明的又一個目的在于提供一種試劑盒，用于以短讀長測序平臺對全長適應性免疫組庫進行測序。

本發明的第五個目的在于提供一種適應性免疫組庫測序方法，以短讀長測序平臺對全長適應性免疫組庫進行測序，有效降低測序的成本，進一步提高測序的通量，提高測序效率。

高通量測序建庫的主要過程是在雙鏈DNA的兩端加上可以被測序儀識別的接頭序列。Tn5是一種轉座酶，轉座酶和兩種等摩爾的測序接頭構成一個完整的轉座子。不同于傳統的末端修復和連接建庫法，使用Tn5轉座子，能夠在一步反應中，快速的將雙鏈DNA片段化，并將測序接頭插入靶基因中，形成帶有接頭的DNA片段。其產物經擴增后可以用于高通量測序。

一種用于實施免疫組庫測序的組合物，包括

逆轉錄引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

鏈置換引物，含有如SEQ ID NO:17所示核酸序列，以及隨機序列標簽；

第一PCR引物對，上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物選自于SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:14之一種或幾種；