[發(fā)明專(zhuān)利]用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的組合物及試劑盒和測(cè)序方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210616324.2
• 申請(qǐng)日: 2022-05-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114934096A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張?zhí)斐?/a>;沈曉蓉;吳斌;施惠娟
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 上海市生物醫(yī)藥技術(shù)研究院
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6806;C12N15/11
• 代理公司: 上海新隆知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 31366
• 代理人: 劉蘭英

1.一種用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的組合物，其特征在于包括：

逆轉(zhuǎn)錄引物，其核酸序列如SEQ ID NO:1所示；

鏈置換引物，含有如SEQ ID NO:17所示核酸序列，以及隨機(jī)序列標(biāo)簽；

第一PCR引物對(duì)，上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物選自于SEQ ID NO:6～SEQ IDNO:14之一種或幾種；

用于裝在Tn5轉(zhuǎn)座酶的核酸，如SEQ ID NO:3所示接頭Tn-A，以及SEQ ID NO:4所示的嵌合端；

第二PCR引物對(duì)，含SEQ ID NO:15所示的上游引物，含SEQ ID NO:16下游引物。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的組合物，其特征在于所述的鏈置換引物3’末端含有3～5個(gè)修飾的G。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的組合物，其特征在于所述的acacgacgctcttccgatct-nnnnnnnn-rgrglnag，其中，nnnnnnnn表示隨機(jī)序列標(biāo)簽。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的組合物，其特征在于第二PCR引物的上游引物為：aatgatacggcgaccaccgagatctacac-8bp barcode-tcgtcggcagcgtcagatgt。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的組合物，其特征在于第二PCR引物的下游引物為：caagcagaagacggcatacgagat-8bp barcode-gtctcgtgggctcggagatg。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的組合物，其特征在于還包括如SEQID NO:5所示的接頭Tn-B。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～6之一所述的用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的組合物用于以短讀長(zhǎng)測(cè)序平臺(tái)對(duì)全長(zhǎng)適應(yīng)性免疫組庫(kù)進(jìn)行測(cè)序。

8.一種用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的試劑盒，其特征在于包括權(quán)利要求1～6之一所述的組合物。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的用于實(shí)施免疫組庫(kù)測(cè)序的試劑盒，其特征在于還包括說(shuō)明書(shū)，其上記載的實(shí)施測(cè)序的方法包括：

逆轉(zhuǎn)錄模板制備：收集待測(cè)試的外周血，加入終濃度1-10倍體積的固定液，10～40℃孵育5～60分鐘；接著加入1～20倍體積的裂解液，25～42℃孵育5-40分鐘；然后300～2000g離心3～10分鐘，收集細(xì)胞沉淀，清洗2-3次，得到細(xì)胞沉淀用作逆轉(zhuǎn)錄模板；

逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：在逆轉(zhuǎn)錄模板中加入逆轉(zhuǎn)錄引物和鏈置換引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，逆轉(zhuǎn)錄條件為：50～60℃，3～10分鐘，然后37～42℃，30～120分鐘，再70～80℃，10～20分鐘；

第一次PCR條件為：94～98℃變性5～10min，然后依次于94～98℃，20～60秒；于55～60℃，5～15秒；于68-72℃，30～120秒為一次循環(huán)，循環(huán)25-35次后，再于68-72℃，5-10分鐘，得到PCR產(chǎn)物；

第二次PCR反應(yīng)條件為：94～98℃變性5-10分鐘后，依次于94～98℃，20-60秒；于55～60℃，5-15秒；以及于68～72℃，30～120秒為一個(gè)循環(huán)，循環(huán)25-35次后，再于68～72℃，5～10分鐘；

產(chǎn)物純化：可通過(guò)磁珠純化的手段對(duì)PCR產(chǎn)物實(shí)施純化。

10.一種以權(quán)利要求1～6之一所述的組合物實(shí)施適應(yīng)性免疫組庫(kù)測(cè)序方法，其特征在于包括如下步驟：

先采用4％多聚甲醛固定液加入的體積為外周血體積的一倍，25℃孵育15分鐘，再加入裂解液為含0.1％的Triton-100的無(wú)RNA酶PBS，其加入體積為外周血的10倍，于72℃，裂解20分鐘以制備逆轉(zhuǎn)錄模板；

然后，在逆轉(zhuǎn)錄模板中加入逆轉(zhuǎn)錄引物和鏈置換引物，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，獲得逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物；

接著，以所得的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)物為模板，以第一PCR引物對(duì)進(jìn)行第一次PCR反應(yīng)，其中上游引物如SEQ ID NO:2所示，下游引物選自于SEQ ID NO:6～SEQ ID NO:14之一種或幾種，取得PCR產(chǎn)物；

之后，將用于裝在Tn5轉(zhuǎn)座酶的核酸預(yù)先退火，等比例混合，再與Tn5轉(zhuǎn)座酶混勻，制備裝載測(cè)序接頭的Tn5轉(zhuǎn)座酶，形成裝載接頭的Tn5轉(zhuǎn)座酶后，加入純化的PCR產(chǎn)物，將PCR產(chǎn)物片段化；

最后，以片段化PCR產(chǎn)物為模板，進(jìn)行第二次PCR反應(yīng)，獲得擴(kuò)增文庫(kù)，純化并分選獲得300-700bp的DNA片段，定量后作為模板上機(jī)測(cè)序，經(jīng)測(cè)序產(chǎn)物可以組裝為全長(zhǎng)序列。